人淋巴瘤细胞株OCI-Ly19生物学特性研究和小鼠模型建立

南 英，韩香萍，路玲玲，向 荣，汪 洋

(基础研究)

人淋巴瘤细胞株OCI-Ly19生物学特性研究和小鼠模型建立

南 英，韩香萍，路玲玲，向 荣，汪 洋

目的 弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)是成人淋巴瘤中最常见的病理类型。DLBCL分型对指导疾病的治疗和预后有较大的意义，但各型DLBCL的发病机制及治疗、预后尚还有待深入研究。文中探索DLBCL细胞株OCI-Ly19的体外培养条件和生物学特性，肿瘤相关分子的表达及DLBCL动物模型的建立方法。 方法 观察OCI-Ly19细胞生长形态及生物学特性，分析比较不同实验条件对细胞生长的影响，用流式细胞术分析相关抗原表达，将OCI-Ly19细胞皮下接种SCID小鼠，观察肿瘤生长状况及组织学形态。结论OCI-Ly19细胞在适当培养条件下生长良好，多数重要的B细胞和肿瘤相关标记物均有不同程度的表达;未经照射的SCID小鼠皮下接种107个OCI-Ly19细胞，成瘤率75%，组织学特征符合人类DLBCL的特点。结果获得了OCI-Ly19细胞株体外培养的最佳条件及相关免疫标志物表达情况。成功构建了人DLBCL的小鼠模型，为进一步进行相关研究提供了实验基础。

弥漫大B细胞淋巴瘤;动物模型;细胞株;OCI-Ly19

0 引 言

DLBCL是成人淋巴瘤中最常见的病理类型［1］。根据免疫组化、基因表达谱及临床资料，可将DLBCL分为2种类型，即生发中心B细胞(germinal center B cell，GCB)样型和非 GCB样型。GCB样型的预后显著优于非 GCB样型。虽然DLBCL分型对指导疾病的治疗和预后均有较大的意义，但各型的发病机制及发病、治疗和预后的相关因子尚有待于深入研究。DLBCL的动物模型为上述研究提供了良好的实验工具［2］。在本研究中我们将人DLBCL细胞株OCI-Ly19注入重症联合免疫缺陷(severe combined immunodefficirncy，SCID)小鼠，探索建立小鼠DLBCL模型的实验条件研究肿瘤生长和组织形态特点，分析培养的肿瘤细胞的免疫标志物。

1 材料与方法

1.1 细胞株及实验动物 人源性GCB样DLBCL细胞株OCI-Ly19［3］，由天津医科大学总医院陈军教授惠赠。细胞置于含10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素、30 μg/ml谷氨酰胺的RPMI1640培养基中，在37℃、5%CO2孵箱中培养。实验动物选用5周龄、体重15 g左右的雌性SCID小鼠，购自中国预防医学科学院动物繁育中心，实验动物许可证号:SYXK(津) 2008－0005。小鼠的饲养及实验均在保持恒温(20～26℃)、恒湿(50%～56%)的无持定病原体(specefic pathoger free，SPF)级鼠房内进行，实验前不经照射等任何处理，实验中随机分组。

1.2 细胞接种 取处于对数生长期的OCI-Ly19细胞，用无血清PBS漂洗2遍并悬浮于无血清PBS中，实验组小鼠每只右侧肋下接种107个细胞。

1.3 小鼠观察和处理 每天观察小鼠的一般状况，成瘤及肿瘤生长情况。每天测量小鼠体重和肿瘤长短径和高度，并计算肿瘤体积，计算方法为长×宽×高［3］。当瘤体达到2 000 mm3时视为人道终点。小鼠经麻醉并拉颈处死，观察体表及各内脏器官成瘤情况和淋巴结转移情况。瘤体置于10%中性甲醛溶液中固定。

1.4 病理组织学 将甲醛固定后的肿瘤组织制作石蜡切片，HE染色观察。

1.5 流式细胞术检测 取体外培养处于对数生长期的OCI-Ly19细胞用PBS漂洗2遍后，置于含2% FBS的PBS中制备1×107cells/ml细胞悬液，加入相应抗体后于4℃避光孵育15 min。对仍需细胞内染色的细胞在表面抗原染色后立即用1%多聚甲醛固定，然后用0.25%皂甙(saponin)处理并加抗体染色，4℃避光孵育过夜。然后将细胞用含2%FBS的PBS漂洗并悬于200 μl PBS中待测。用美国Becton Dickinson公司的FACScan流式细胞仪检测样品，每份样品均测定2～3×105细胞，并采FlowJo软件对结果进行分析。检测中采用10种抗体:CD19/APC (BD Pharmingen)、CD20/PE(BD Pharmingen)、CD24/ PE(BD Pharmingen)、CD38/PE(eBioscience)、c-Met/ FITC(eBioscience)、CD81/FITC(Santa Cruz)、Ki-67/ FITC(eBioscience)、Bcl-2/purified(Abcam)、survivin/ purified(Abcam)。Bcl-2及survivin的二抗为山羊抗兔IgG/FITC(eBioscience)。

2 结 果

2.1 OCI-Ly19细胞体外培养特性

2.1.1 细胞生长形态观察 正常OCI-LY19细胞大小均匀，呈圆形或卵圆形，透光度较好，核大，可见明显的核仁，大多位于细胞核的周边。在培养基中悬浮生长，复苏后呈单个悬浮细胞，静置培养约4 h后，细胞开始成团生长，约10～13个细胞，见图1a。随静置培养时间延长，细胞团块增大，团块中细胞数量增加。当团块过大，含有30～40个以上细胞，位于中间位置的细胞由于缺乏营养，表面僵硬、皱缩，透光度减少，最终死亡，见图1b。因此，每隔10 h左右须晃动培养瓶，使细胞团块散开。细胞用10%含20%FCS的DMSO冻存，复苏后细胞存活率均在90%以上。

2.1.2 不同浓度血清对OCI-Ly19细胞生长的影响本OCI-Ly19细胞体外培养均采用HyClone公司的RPMI1640培养基及Gibco公司的澳洲FBS。分别采用不同浓度(5%、10%和15%)FBS培养后发现，采用10%FBS培养，细胞在第2天进入指数生长期，第4天达到生长高峰，细胞数由初始的106增至5×107，其生长速度和传代周期适中;细胞生长状态良好，活力旺盛，接种的动物成瘤率较高。不同血清浓度下细胞生长曲线如图1c。

图1 OCI-Ly19细胞培养Figure 1 Culture of OCI-Ly19 cells

2.2 动物模型的构建和观察

2.2.1 成瘤率和成瘤部位 皮下注射107个细胞的8只SCID小鼠中，6只成瘤，成瘤率75%。成瘤小鼠均在右侧肋部皮下形成瘤块，与注射部位一致。体表未见其他部位成瘤。解剖后仔细观察全身淋巴结、各脏器及皮下组织，均未发现转移瘤的发生。且瘤组织被覆完整包膜，其周围组织未见浸润。成瘤小鼠与其他未成瘤小鼠或正常组小鼠相比，均出现行动缓慢、精神萎靡、竖毛、易激惹、易惊吓等症状。小鼠体重变化曲线见图2a。

2.2.2 成瘤时间及肿瘤生长 6只成瘤小鼠的成瘤时间为(25.2±1.7)d。肿瘤生长曲线如图2b。

图2 肿瘤模型的建立Figure 2 Establishment of a DLBCL model in mice a:荷瘤小鼠和正常小鼠体重变化曲线;b:肿瘤生长曲线

2.2.3 肿瘤外观 在6只成瘤小鼠右侧肋部皮下可见1个瘤结节，为扁丘状实体，圆形或卵圆形，中部凸起，见图3a。解剖取材时见瘤组织质地柔韧，表面被覆完整结缔组织包膜，边界清晰，与周围组织无粘连，可见丰富的新生血管长入瘤组织，见图3b。

图3 肿瘤外观Figure 3 Tumors in SCID mice induced by subcutaneous injection of OCI-Ly19 cells

2.3 肿瘤的组织学检查 瘤组织切面呈鱼肉样质地，色粉红。其中心部未发生出血、坏死，不伴有纤维化。切片HE染色可见瘤细胞大小较一致，细胞呈圆形或卵圆形，弥漫性分布，细胞质少，核大、深染，核内可见多个清晰核仁。可见丰富的新生血管，见图4a和核分裂相，见图4b。

图4 肿瘤组织学表现Figure 4 Histology of DLBCL

2.4 OCI-Ly19细胞的表面抗原 OCI-Ly19细胞在DLBCL分型中属于GCB亚型［3］，表现为CD10+/bcl-6+。其中CD19+占99.5%以上。本研究流式细胞术分析首先以CD19设门，以排除背景干扰，见图5a。

2.4.1 B细胞或肿瘤相关标志物 利用流式细胞术检测OCI-Ly19细胞表面B细胞或肿瘤相关抗原表达，共检测3次。CD20、CD24、CD38和CD81的阳性率分别为(75.3±7.0)%、(51.5±7.3)%、(98.5±1.2)%和(50.3±19.2)%。图5b示1次流式细胞术检测的结果。

图5 肿瘤细胞的流式检测Figure 5 FACS analysis of OCI-Ly19 cells

2.4.2 细胞增殖与细胞凋亡相关标志物 对OCILy19细胞表面与细胞增殖和细胞凋亡相关标志物的表达进行了3次独立流式细胞术检测分析，阳性率和平均荧光强度(mean fluorescence intensity，MFI)结果见表1。

表1 肿瘤细胞增殖与凋亡相关标志物表达Table 1 Expressions of proliferation-and apoptosis-associa ted markers in OCI-Ly19 cells

3 讨 论

DLBCL的形态学、病理组织学及临床表现上有明显的异质性，免疫表型与预后的关系十分密切。研究与DLBCL预后相关的因素对疾病的诊断分型、临床治疗和预后评估都具有重要意义［4］。基因表达谱的差异导致DLBCL的异质性，并影响疾病的预后。由于技术条件的限制，基因表达谱分析难以在临床广泛应用。Hans等［5］于2004年首次应用免疫组化方法根据细胞表面CD10、bcl-6和MUM-1的表达对DLBCL分型。免疫组化分型方法与基因表达谱分型方法相比，符合率达到80%以上，已为临床普遍接受，并于2008年被WHO造血和淋巴组织肿瘤分类方案推荐使用［6］。DLBCL细胞表面蛋白的表达对DLBCL的诊断分型和临床治疗及预后评估均具有重要意义。目前大量研究致力于寻找对评价DLBCL患者生存和预后具有指导意义的相关因素，包括基因表达和免疫组化的细胞表面标志。

本研究用免疫组化方法检测了体外培养的人类来源的DLBCL细胞株OCI-Ly19的细胞表面标志物。OCI-Ly19属于GCB亚型，几乎全部表达CD19。CD20在B细胞活化中起重要作用，前B细胞直至分化到前浆细胞均表达CD20。应用抗CD20单克隆抗体Rituximab(商品名为美罗华)，联合传统化疗可使DLBCL患者的长期生存率提高10%以上。本研究发现体外培养的OCI-Ly19细胞CD20表达率达75%以上。CD24参与调节B细胞的增殖和成熟。CD38在调控细胞生长和分化中发挥重要作用，在未成熟B细胞中高水平表达。CD81表达于正常的生发中心B细胞和GCB型DLBCL细胞。上述B细胞相关标志物在OCI-Ly19细胞中均有较高表达，尤其是CD38的阳性表达率达98%以上，提示大部分细胞处于活化和增殖活跃的状态。

原癌基因c-Met编码的蛋白具有酪氨酸激酶活性，调节细胞的增殖和运动，多种恶性肿瘤的发生和转移过程中均有c-Met过度表达［7］。Ki-67与细胞增殖特异性有关，主要用于判断细胞增殖活性［8］。在DLBCL中，Ki-67细胞阳性率反映增生细胞的百分率。bcl-2在细胞凋亡中起重要的调控作用，是细胞凋亡的重要抑制性因素。在DLBCL中bcl-2高表达较为常见，约30%～60%的DLBCL病例表达bcl-2［5］。存活蛋白(survivin)也属于凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAP)家族，多数DLBCL细胞均有表达［9］。近年有研究者发现survivin还与鼻型NK/T细胞淋巴瘤具有高度相关性［10］。本研究结果显示，上述与肿瘤细胞增殖和凋亡相关的标志物在体外培养的人DLBCL细胞中虽有表达，但阳性率远低于文献报道的临床标本，约为临床标本阳性率的50%左右。这种现象很可能与缺乏体内和肿瘤微环境中多种因素的作用有关。在本研究的基础上，我们已对相关的免疫标志物接种前后的表达进行对比研究。

DLBCL的发生发展与体内多种因素密切相关，体外DLBCL细胞株培养难以正确模拟DLBCL的生物学行为。淋巴瘤动物模型分为自发性、诱发性、转基因和移植性等多种类型。自发性淋巴瘤动物模型的成瘤时间长，均一性差。诱发性和转基因模型存在拷贝数的不可控性及结合位点的随机性等缺点。移植性模型可较好地保持所种植的人淋巴瘤的组织学特点，因而我们选用种植人类来源的DLBCL细胞构建动物模型。本研究结果表明，应用OCI-Ly19细胞可成功建立人DLBCL的小鼠模型，其组织学特征符合人DLBCL的特点，稳定性和重复性均较为理想。皮下注射方法简单，成瘤率高，较易复制，已广泛应用于研究人类肿瘤的免疫遗传特点及抗肿瘤药物的疗效［11］。由于SCID小鼠体内尚残留较强的非特异性免疫活性，在移植肿瘤前常予以全身辐射，以杀伤小鼠体内的NK细胞和LAK细胞，提高移植瘤的成活率。本研究中接种OCI-Ly19细胞的SCID小鼠未作照射处理，仍具有较高的成瘤率，分析其原因应与接种的肿瘤细胞数量和状态有关。经反复实验发现，良好的生长状态和足够的细胞数(不少于107)是获得高成瘤率的重要条件。本研究采用SCID小鼠建立人DLBCL肿瘤模型，是由于SCID小鼠体内缺乏成熟的T细胞和B细胞，有利于采用人类来源的淋巴细胞再灌注建立人源化动物模型，深入研究抗肿瘤的免疫反应［12］。

［1］ Willetts IE，Tam PK，Morris PJ，et al.Treatment with an HLA-peptide and cyclosporine A prolongs rat small bowel allograft survival［J］.J Pediatr Surg，1997，32(3):469-472.

［2］ Yanagisawa Y，Sato Y，Asahi-Ozaki Y，et al.Effusion and solid lymphomas have distinctive gene and protein expression profiles in an animal model of primary effusion lymphoma［J］.J Pathol，2006，209(4):464-473.

［3］ Lyu MA，Rai D，Ahn KS，et al.The rGel/BLyS fusion toxin inhibits diffuse large B-cell lymphoma growth in vitro and in vivo［J］.Neoplasia，2010，12(5):366-375.

［4］ 胡成如，王靖华.弥漫性大B细胞淋巴瘤相关预后因素的研究进展［J］.医学研究生学报，2010，23(10):1098-1103.

［5］ Hans CP，Weisenburger DD，Greiner TC，et al.Confirmation of the molecular classification of diffuse large B-cell lymphoma by immunohistochemistry using a tissue microarray［J］.Blood，2004，103(1):275-282.

［6］ Steven H，Elias C，Nancy LH，et al.WHO classification of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues［M］.4 ed.Lyon:IARC Press，2008:441-442.

［7］ Drebber U，Baldus SE，Nolden B，et al.The overexpression of c-met as a prognostic indicator for gastric carcinoma compared to p53 and p21 nuclear accumulation［J］.Oncol Rep，2008，19 (6):1477-1483.

［8］ Tsamandas AC，Kardamakis D，Tsiamalos P，et al.The potential role of Bcl-2 expression，apoptosis and cell proliferation(Ki-67 expression)in cases of gastric carcinoma and correlation with classic prognostic factors and patient outcome［J］.Anticancer Res，2009，29(2):703-709.

［9］ Adida C，Haioun C，Gaulard P，et al.Prognostic significance of survivin expression in diffuse large B-cell lymphomas［J］.Blood，2000，96(5):1921-1925.

［10］ 王靖华，金永丽，陈龙邦，等.鼻型NK/T细胞淋巴瘤中Survivin和caspase-3表达意义的初步研究［J］.医学研究生学报，2008，13(1):49-52.

［11］ Bosma GC，Davisson MT，Ruetsch NR，et al.The mouse mutation severe combined immune deficiency(scid)is on chromosome 16［J］.Immunogenetics，1989，29(1):54-57.

［12］ 马春芳，李芳秋.霍奇金淋巴瘤的靶向治疗药物SGN-35［J］.医学研究生学报，2011，24(8):862-865.

Human diffuse large B-cell lymphoma cell line OCI-Ly19:Biological characteristics and establishment of a mouse model

NAN Ying1，HAN Xiang-ping2，LU Ling-ling1，XIANG Rong1，WANG Yang1
(1.Laboratory of Molecular Virology and Viral Immunology of School of Medicine，2.Department of Biochemistry and Molecular Biology of School of Life Sciences，Nankai University，Tianjin300071，China)

Objective Diffuse large B-cell lymphoma(DLBCL)is a most common pathological type of lymphoma in adults.The typing of DLBCL helps a lot the treatment and prognosis of the disease，and deeper studies are needed on the pathogenesis，management and prognosis of different types of DLBCL.The aim of this study was to investigate the in vitro culture conditions and biological characteristics of OCI-Ly19 cells of human DLBCL，the expression of tumor-associated molecules and the establishment of an animal model of human DLBCL. Methods We observed the histological and biological characteristics of OCI-Ly19 cells under different culture conditions，analyzed the expressions of B-cells and tumor-related markers by flow cytometry，and observed the formation and histology of tumors following subcutaneous injection of OCI-Ly19 cells into SCID mice. Results OCI-Ly19 cells grew well under appropriate culture conditions.Flow cytometry showed high expressions of B-cells and tumor-related markers(50%－98%)and median expressions of proliferation-and apoptosis-related markers(20%－53%)of the cultured OCI-Ly19 cells.Subcutaneous injection of 107 OCI-Ly19 cells into the SCID mice produced 75%of tumor formation with the characteristics of human DLBCL. Conclusion We obtained most appropriate conditions for the in vitro culture of OCI-Ly19 cells and the expressions of relevant immune markers，and successfully established a mouse model of human DLBCL.

Diffuse large B-cell lymphoma;Animal model;Cell line;OCI-Ly19

R733

A

1008-8199(2012)08-0793-05

天津市科委中国瑞典合作重大项目(09ZCZDSF04000)

300071天津，南开大学医学院分子病毒和病毒免疫实验室［南 英(医学硕士研究生)、路玲玲、向 荣、汪 洋］，南开大学生命科学学院生物化学和分子生物学系［韩香萍(生理学硕士研究生)］

汪 洋，E－mail:yangwang@nankai.edu.cn

2011-05-25;

2011-07-01)

(责任编辑:齐 名;英文编辑:罗永合)