金标试纸在猪场疫病防控上的应用

2012-12-24林小英沈育华沈永栋游根勇郭书林黄印尧

福建畜牧兽医 2012年6期

林小英沈育华沈永栋游根勇郭书林黄印尧

（1.厦门市牧兴实业有限公司 361100；2.厦门出入境检验检疫局 361026）

为了保证猪场生产的安全，一个种猪场，每年都必须开展疫病抗体检测，及时掌握猪群的健康水平，就可以有效防止疫病的发生和流行。当前我国开展抗体检测的常用方法有乳胶凝集法、间接血凝法、酶联免疫吸附法、金标法等。金标法是近年来研发的一种新的检测方法，目前我们已研制出检测猪瘟抗体、猪伪狂犬病抗体、猪蓝耳病抗体、猪圆环病毒（PCV-2）病抗体和口蹄疫（O型）抗体的金标检测试纸。

1 金标检测试纸

1.1 金标法的原理胶体金是一种负电荷的疏水胶体，同时胶体金颗粒对蛋白质有很强的吸附功能，可与毒素、酶、糖蛋白、抗生素和激素等多种物质非共价结合，成为免疫反应的优良标记物。应用层析技术和吸水纸的引力，标志的抗原（抗体）与对应的抗体（抗原）可以直接在硝酸纤维膜上进行反应，形成肉眼可见的紫红色抗原抗体复合物。

1.2 免疫金标试纸的制作方法采用胶体金免疫层析技术，以猪瘟抗体金标试纸为例，将猪瘟抗原包被在硝酸纤维薄膜上的检测线上，将兔抗猪瘟抗原抗体包被在硝酸纤维薄膜的对照线上，猪瘟抗原经胶体金标记后喷在玻璃纤维膜上，干燥后附着在硝酸纤维薄膜的下端，在硝酸纤维薄膜的上端粘贴着吸水纸，见图1。当血清或血液样品滴加于加样处，如果加入血液，试剂中的红细胞过滤系统会自动的将红细胞拦下而让血清通过。由于层析原理，血清开始向吸水纸上部移动，当液体遇到干燥的胶体金猪瘟抗原时将其溶解，并继续往上移动至硝酸纤维膜的检测区。如果样品中有猪瘟抗体存在，包被在检测线上猪瘟抗原和金标猪瘟抗原与样品中的猪瘟抗体将会在检测线上形成一个双夹心的免疫复合物，并在检测线上形成一条红色或紫红色线。如果样品中没有猪瘟抗体，金胶体猪瘟杭原将不会与包被在检测线上的猪瘟抗原形成复合物，检测线上没有色带出现。样品的血清和胶体金猪瘟抗原继续往上移动至对照线上的兔抗猪瘟抗原抗体将会与胶体金标志的猪瘟抗原结合，在对照线上形成一条红色或紫红色，说明本试剂有效。

图1 金标试纸示意图

图2 结果判定示意图

1.3 操作方法和判定标准按照已发布的福建省地方标准（猪瘟抗体金标试纸检测方法DB35/916-2009）操作。

1.3.1 操作方法撕开铝箔袋，将检测卡平放于桌面上，在检测卡圆形加样孔（S）内加入100 uL待检样品（血液或血清），室温下静置15 min判定结果。

1.3.2 判定标准见图2。无效：在对照线（C）和检测线（T）都不出现紫色线；阴性：在对照线（C）出现一条色线，在检测线（T）不出现色线，说明待检测样品是阴性，或抗体滴度达不到抵御野毒攻击的最低保护水平；阳性：对照线（C）和检测线（T）都出现一条紫红色线，则为阳性。检测线颜色越深，说明抗体滴度越高。检测线（T）出现一条颜色很浅的紫色线，则样品呈弱阳性，说明抗体滴度已达到抵御野毒攻击的最低保护水平。

1.4 金标法与其他检测法的比较从表1可以看出，金标试纸与其他试剂一样，具有微量、特异、准确的优点，试剂单份包装、常温保持、保质期长（一年以上），检测时不需要特定的任何仪器设备，待检样品可以是血清、溶血血清或血液；检测方法简便、检测流程仅需15 min，结果直观容易判定，可以单份样品检测，检测成本低廉，每份样品只需3～5元。虽然，在检测结判定上，金标试纸不能像ELISA那样用OD值数字表示，但金标法可以通过检测线颜色的深浅表达抗体水平的高低。鉴于金标试纸有其独特的优点，它特别适用于基层兽医站和养猪场使用。

表1 金标法与其他检测法的比较

2 免疫金标试纸在猪场疫病防控上的应用

牧兴实业有限公司有一个4000头母猪和年出栏3万头大猪的猪场，每年都对种公猪、后备母猪和生产母猪进行1～2次的猪五大疫病（猪瘟、蓝耳病、伪狂犬病、口蹄疫和圆环病毒病）免疫抗体检测，以前应用进口试剂，要成批采集血清，溶血的样品不能检测，检测的时间长，更主要是成本很高。近年来，采用金标试纸检测，采集的血液、血清、溶血的血清样品都可以用。操作简便、而且检测的成本很低，在实际使用中，总结出以下几点经验。

2.1 选择适合本场使用的疫苗（即检验购买的疫苗的质量）猪场新购进的批量疫苗，使用前应进行疫苗的质量检查、选择适合本场使用的疫苗。以猪瘟疫苗为例，具体做法是选择健康生猪，猪瘟抗体水平是阴性，先取一瓶猪瘟疫苗，根据说明书要求的剂量注射疫苗。等待产生抗体达到最高的时候（活疫苗注射后28 d；灭活疫苗注射后35 d），抽取血液或经离心的血清，应用猪瘟抗体金标试纸进行抗体检测，如果抗体水平达标，该批疫苗可以使用；如果抗体水平不达标，该批疫苗不能使用，要查找原因，是疫苗本身质量或其他原因，需再试验，或另换其他厂家疫苗。

2.2 开展猪场抗体水平普查为了保证猪群生产的安全，对一个种猪场，每年都必须开展疫病抗体的检测，及时掌握猪群的健康水平，就可以有效防止疫病的发生和流行。具体做法是根椐猪场历年发生疫病的情况，每年必须开展2次抗体普查，重点以种猪为主，抽检比例为：种公猪100%，后备母猪配种前100%，生产母猪5%～10%，不同日龄（保育舍小猪、中猪）菜猪抽检0.5%～1%，检测的项目一般以猪的五大疫病（猪瘟、伪狂犬病、蓝耳病、圆环病毒病、口蹄疫）为主。根椐检测结果，分析各种抗体水平的达标率和离散度，并对猪场的健康水平进行综合评价。根椐我们近年来检测结果统计，如果同一种抗体水平参差不齐，离散度大，就有可能近期发病，如果离散度小，猪群较安全。如果猪瘟抗体水平达标，一般蓝耳病、伪狂犬病和圆环病毒病的抗体也基本能达标；猪瘟抗体不达标，则蓝耳病、伪狂犬病、圆环病毒病抗体中都有不达标出现，因此，如果猪场的猪瘟抗体能保持较高水平，一般说猪场是比较安全的。

2.3 制定正确的免疫程序目前国家有出台指导性的生猪免疫程序，但各猪场有不同的疫病情况，应根椐抗体水平的消长规律进行调整。目前报道较多的是猪瘟、口蹄疫，可以用金标试纸进行检测，先测定母源抗体水平，决定首免时间，根据首免后的抗体水平决定二免时间。这样制定的免疫程序更适合本场使用。

2.4 猪场猪瘟净化

2.4.1 操作方法首先是种猪要先净化，种猪每年接种猪瘟疫苗2～3次，要求所有公猪、经产母猪的猪瘟抗体水平达到合格以上（即在试纸的检测线颜色要深）。后备母猪一般仅接种过猪瘟疫苗2～3次，其抗体水平要比种猪和经产母猪低，但都必需达到合格水平。对抗体水平不合格的种猪要加大剂量进行猪瘟疫苗免疫，间隔1个月后再抽血测定猪瘟抗体，如果达标的算合格；如未能达标还应再次加大剂量免疫，间隔1个月再测定，如果猪瘟水平不达标则视为猪瘟带毒猪、或严重感染了免疫抑制病毒，应淘汰。为保持本场种猪群猪瘟的净化，每年均应开展2次猪瘟抗体检测。

2.4.2 净化结果判定种公猪和经产母猪每年经过2～3次的猪瘟疫苗接种，要求所有公猪、经产母猪的猪瘟抗体水平达到合格以上（即在试纸的检测线颜色要深）。后备母猪一般仅接种过猪瘟疫苗2～3次，其抗体水平会比种猪和经产母猪低，但都必需达到合格水平。

对抗体水平不合格的种猪要加大剂量再次进行猪瘟疫苗免疫，间隔1个月后再抽血测定猪瘟抗体，如果达标的算合格；如未能达标还应再次加大剂量免疫，间隔1个月再测定，如果猪瘟水平不达标则视为猪瘟带毒猪、或严重感染免疫抑制病毒，应淘汰。

为保持本场种猪群猪瘟的净化，每年均应开展2次猪瘟抗体检测。

2.5 为疫病诊断提供依据当前发生的猪病大都是多病原混合感染，症状不典型，给诊断造成很大困难，诊断时可以采取以下方法。

1）根据患猪的临床表现和病理变化推测出可能是**病。

2）根椐猪只免疫情况，推测猪在正常情况下应该保持的抗体水平，如猪注射**疫苗后的1～3个月间应该有保护性抗体，如果没有保护性抗体，就有可能是疫苗质量、免疫程序或免疫抑制病毒的干扰等原因；如猪不注射**疫苗，就不可能产生**抗体，如有产生就可能是野毒感染的缘故，而且抗体水平较高。

3）抽取数头患猪血液就地进行抗体水平检测（一般要检测猪瘟、蓝耳病、伪狂犬病、圆环病毒病抗体），根椐三方面结果，就可以得出基本正确的诊断意见。比如，临床有蓝耳病的肺部病变，猪曾经注射过猪瘟疫苗2次、蓝耳病疫苗2次、伪狂犬病疫苗2次和圆环病毒病疫苗1次，原来都应产生抗体，抽血检测发现，仅猪瘟有弱阳性抗体，其余都没有抗体存在，综合判断应该是蓝耳病。