蓝莓叶水提物的体外抗氧化活性

朱晓红，沈佳鑫，马 瑞，徐丽珊

（浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江金华321004）

抗氧化剂是食品、医药等行业不可缺少的添加剂，它能阻止或延迟食品氧化，以提高食品的稳定性和保存期。目前，市场上的抗氧化剂主要分为天然抗氧化剂和化学合成抗氧化剂。由于化学合成抗氧化剂具有一定的毒性、致畸性和潜在的致癌性，使用过多会对人体健康造成重大危害。因此，寻找安全、高效的天然抗氧化剂成为近年来的一大研究热点。天然抗氧化剂主要来源于植物，具有化学合成抗氧化剂所没有的诸多优点。

蓝莓（blueberry）又称越橘，属杜鹃花科（Ericaceae）越橘属（Vaccinium.spp）多年生落叶或常绿灌木。大量研究表明，蓝莓果中含有丰富的抗氧化物质，能延缓衰老[1]。但蓝莓果产量较少，价格较昂贵，使蓝莓果的试验研究受到了一定程度的限制。因而，一些研究者近年来开始对蓝莓叶进行研究，发现蓝莓叶中同样含有丰富的抗氧化物质[2]。而且在我国蓝莓叶资源目前还没有得到很好的利用。因此，开发蓝莓叶中丰富的抗氧化物质具有广阔的前景。国内外对蓝莓叶的研究主要集中在抗氧化物质的提取和纯化方面，对于抗氧化物质的体外抗氧化活性研究不多。

本试验通过设定一定的浓度梯度对蓝莓叶水提物的体外抗氧化活性进行研究，对研究蓝莓叶中抗氧化物质及开发新型天然抗氧化剂具有重要意义[3]。

1 材料和方法

1.1 主要试剂与仪器

试剂：维生素C（上海青析化工科技有限公司）、BHA、蓝莓叶、磷酸盐缓冲液（pH 值为6.6）、六氰合铁酸钾溶液、三氯乙酸、三氯化铁溶液、DPPH（上海如吉生物科技有限公司）、FeSO4、水杨酸、H2O2、总抗氧化能力（T-AOC）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

仪器：恒温烘箱、电子天平、旋转蒸发器、恒温水浴锅、离心机、分光光度计、pH 计。

1.2 试验方法

1.2.1 蓝莓叶水提物提取 取一定量蓝莓叶并剪碎，用料液比为1∶14 的蓝莓叶与自来水混合，再用0.1 mol/L 的盐酸调到pH 值为2.0，在100 ℃的沸水浴中提取60 min。将提取液旋转蒸发浓缩，置于60 ℃烘箱中烘干，制成粉末备用[4]。

1.2.2 蓝莓叶水提物含量测定 采用硫酸-香草醛法[5]和芦丁法测定水提物中的原花青素和黄酮含量。

1.2.3 蓝莓叶水提物还原力测定 取不同浓度蓝莓叶水提物溶液2.5 mL 于试管中，依次加入2.5 mL 0.2 mol/L 磷酸盐缓冲液和2.5 mL 1%六氰合铁酸钾溶液。50 ℃水浴保温20 min，快速冷却，再加入2.5 mL 10%三氯乙酸，3 000 r/min 离心10 min，取上清液2.5 mL，依次加入2.0 mL 蒸馏水、0.5 mL 0.1%三氯化铁溶液，充分混匀，静置10 min 后，在700 nm 处测定吸光度值[6]。

1.2.4 蓝莓叶水提物对DPPH·自由基清除活性的测定 DPPH·自由基（1，1-二苯基苦基苯肼）是一种人工合成的稳定自由基，其甲醇溶液显紫色，在516 nm 处有最大吸收。当有自由基清除剂存在时，DPPH·的单电子由于被配对，其浓度减小而颜色变浅，在波长516 nm 处的吸光度值减小，对DPPH·自由基的淬灭能力可以有效地评价抗氧化剂的活性。DPPH·自由基清除活性测定参照文献[7-10]进行。

DPPH·自由基的清除率计算公式为：GDPPH＝（1－（Ai－Aj）Ac）×100%。其中，GDPPH为清除率，Ai表示待测样品液与DPPH 混合液在516 nm 处的吸光度值，Aj表示待测样品液与无水乙醇混合液在516 nm 处的吸光度值，Ac表示无水乙醇与DPPH 混合液在516 nm 处的吸光度值。

1.2.5 蓝莓叶水提物总抗氧化能力的测定 参照南京建成生物工程研究所生物总抗氧化能力（T-AOC）测试盒说明书进行。

2 结果与分析

2.1 蓝莓叶水提物含量测定

2.1.1 原花青素标准曲线及其含量 采用硫酸-香草醛法，测得不同浓度的原花青素溶液在500 nm 处的吸光度值（图1）。原花青素质量浓度在0～0.1 mg/mL 范围内具有良好的线性关系。其回归方程为y＝1.305 8x，R2＝0.998 1，其中，y为试验所得的吸光度值（ABS），x 为样品质量浓度（mg/mL）。根据回归方程，对蓝莓叶水提物溶液进行测定，通过计算得出蓝莓叶水提物中原花青素含量为14.1%±0.9%。

2.1.2 芦丁标准曲线及其含量 将芦丁配制成不同浓度的溶液，并测定其在510 nm 处的吸光度值（图2）。芦丁质量浓度在0～25 μg/mL 范围内具有良好的线性关系。回归方程为y＝0.030 4x＋0.000 4，R2＝0.999 6，其中，y 为试验所得的吸光度值（ABS），x 为样品质量浓度（μg/mL）。根据回归方程，对蓝莓叶水提物溶液进行测定，通过计算得出蓝莓叶水提物中黄酮含量为30.3%±0.1%。

2.2 蓝莓叶水提物还原力测定

本试验将不同的抗氧化剂配制成同一浓度梯度的溶液，用还原力测定方法分别测定其在700 nm 处的吸光度值。吸光度值越大，表示还原力越强（图3）。

通过图3 及T 检验分析发现，在6～36 μg/mL范围内，BHA 和Vc 的还原力均高于蓝莓叶水提物，且差异极显著。不同抗氧化剂的还原力随着浓度的增大而增强，且水提物随着浓度的增大，还原力增强较缓；而Vc 和BHA 随着浓度的增大，还原力增加较快。

将蓝莓叶水提物分别与Vc，BHA 等质量配制成12 μg/mL 的混合溶液，测定混合物的还原力（表1）。

表1 混合物还原力比较

表1 中的还原力数据经T 检验分析表明，（6 μg Vc＋6 μg 水提物）/mL 混合溶液的还原力均高于12 μg/mL Vc 的还原力和12 μg/mL 水提物的还原力，且差异极显著。说明了Vc 和蓝莓叶水提物之间存在协同作用。但BHA 与水提物按等质量混合配成（6 μg BHA＋6 μg 水提物）/mL混合溶液时，其还原力小于12 μg/mL BHA 的还原力，但大于6 μg/mL BHA 的还原力，且差异均达极显著水平。由此说明，我们可以通过增加水提物的量，减少BHA 的量来达到相同的还原效果。

2.3 蓝莓叶水提物对DPPH·自由基的清除作用

试验测定了蓝莓叶水提物、BHA 和Vc 在同一浓度梯度时，对DPPH·自由基的淬灭能力，其结果如图4 所示。

经过图4 以及T 检验分析发现，在2.5～15.0 μg/mL 质量浓度范围内，蓝莓叶水提物对DPPH·自由基的清除能力均小于Vc 和BHA，且差异极显著。蓝莓叶水提物的清除率在10%～50%之间，清除率与水提物浓度之间近似正比例关系。但BHA 和Vc 在质量浓度超过10 μg/mL时，它们的清除率增加不再明显，基本稳定在90%以上。

将Vc，BHA 和蓝莓叶水提物按等质量配制成5 μg/mL 的混合液，测定其对DPPH·自由基的清除率。表2 结果经T 检验分析表明，（2.5 μg BHA＋2.5 μg 水提物）/mL 混合溶液的DPPH·自由基清除率大于2.5 μg/mL BHA 对DPPH·自由基的清除率，小于5 μg/mL BHA 对DPPH·自由基的清除率，但差异都不显著。这一结果说明，在食品中添加BHA 时可用一部分蓝莓叶水提物来代替，以减少人工合成抗氧化剂给人们健康带来的危害。

表2 混合物对DPPH·自由基清除率的比较

2.4 蓝莓叶水提物总抗氧化能力的测定

总抗氧化体系是检验抗氧化剂在食品体系中抗氧化作用的常用体系。本试验将抗氧化剂配制成溶液，测定水提物、Vc 和BHA 的总抗氧化能力，其结果如图5 所示。

从图5 可以看出，在总抗氧化能力上，当质量浓度为40 μg/mL 时，BHA 的总抗氧化能力大于水提物，且差异达极显著水平；当质量浓度为80，200 μg/mL 时，BHA 的总抗氧化能力也大于水提物，且差异显著；但当质量浓度为120，160，240 μg/mL 时，水提物与BHA 的总抗氧化能力相近，二者差异不显著。而Vc 的总抗氧化能力很强，当质量浓度为40 μg/mL 时，其总抗氧化能力就超过水提物与BHA 最大浓度时的总抗氧化能力。

3 结论与讨论

本试验通过对蓝莓叶水提物的还原力、DPPH·自由基的清除能力和总抗氧化能力的测定，并以Vc 和BHA 为对照，来检测水提物的抗氧化能力，同时考察了Vc 和BHA 对水提物抗氧化效果的影响。结果表明，蓝莓叶水提物的还原力和DPPH·自由基的清除能力均低于Vc 和BHA，且差异达极显著水平。但在还原力上，水提物与Vc 之间存在协同作用。因此，二者可同时使用。在DPPH·自由基清除能力上，可通过增加水提物的量，减少BHA 的量来达到相近的清除率。在总抗氧化能力上，虽然Vc 的活性很强，但BHA 和水提物差不多强弱，说明可以用蓝莓叶水提物代替BHA，或者与BHA 混用，减少BHA的用量，减少其对人体健康的危害。因为在我国蓝莓叶资源丰富，提取工艺简便，蓝莓叶水提物作为一种新型天然抗氧化剂应用前景广阔。

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［4］徐丽珊，黄启亮，汪雪君.蓝莓叶中抗氧化物质提取工艺研究[J].食品工业科技，2011，9（2）：270-272.

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［6］李颖畅，孟宪军.蓝莓叶黄酮提取物抗氧化活性的研究[J].营养学报，2008，30（4）：427-428.

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