生物医用透明质酸多糖的改性和功能化研究

吴莉娇，栾 途，张 飞，张洪斌

上海交通大学 化学化工学院 高分子科学与工程系，上海200240

透明质酸(hyaluronic acid，HA)是一种天然聚阴离子粘多糖，由D-葡萄糖醛酸(glucuronic acid)和D-N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetyl glucosamine)以β-1，4 和β-1，3 糖苷键交替连接而成［1］，其化学结构如图1 所示。HA 几乎存在于所有的哺乳动物体中，通常以盐的形式存在。在人体内HA 分布广泛，例如在眼玻璃体、关节液、脐带和皮肤中均存在较高浓度的HA，肺、肾脏、大脑和肌肉组织里也发现有HA的存在。人体不断地合成，也在不断地代谢HA。HA 在生物体中具有多种生理和机械功能，如保持水分、调节渗透压、维持组织形态、屏障扩散、润滑关节、缓冲应力等［2］。更为重要的是，HA 能够被特定的细胞受体如CD44［3］识别，从而调控细胞的粘附、生长和分化，调控免疫反应、血管化和愈合等生理过程［4］。在具有上述重要生理功能的同时，由于HA在人体中是天然存在的，具有良好的生物相容性、生物降解性和非免疫原性，因此在医学领域具有重要和广泛的应用。

但是通过对HA 应用效果的研究(如对骨关节炎的治疗和术后粘连的预防)发现，HA 无法提供持久的治疗功效。这主要是由于HA 具有高水溶性，对自由基及透明质酸酶敏感，容易发生降解［5］。HA体内保留时间短，在水体系中缺乏力学强度［6］，限制了其应用，因此对HA 进行改性以提高其抗降解性和力学强度显得尤为重要。许多学者对天然HA进行了化学修饰或复合改性，以弥补上述不足，研发出了具有一定力学强度、高稳定性的衍生物，其中部分衍生物已被广泛应用于医药、食品和高级化妆品等领域。HA 可进行改性的基团包括羧基、羟基、乙酰氨基和还原末端。主要的化学改性方法有交联、酯化、接枝等，而物理方法有复合改性。本文主要对近年的HA 改性研究及其医学应用进行了详细综述。

图1 透明质酸的分子结构Fig.1 The molecular structure of hyaluronic acid

1 交联改性

交联是HA 形成凝胶的最普遍的改性方式，可以发生交联的最重要的基团是羧基和羟基。羟基通过醚键交联，而羧基通过酯键交联。交联后，HA 分子量明显增加，根据交联程度的不同，交联产物外观上有明显的差异。

1.1 羟基交联

1.1.1 环氧化合物交联

HA 可与多种环氧化合物在碱性条件下发生交联反应，制备不同用途的凝胶。如Lebreton［7］采用1，4-丁二醇二缩水甘油醚、1，4-二(2，3-环丙氧基)丁烷及1，4-二缩水甘油丁烷等环氧化合物来交联HA。Sakurai 等［8］采用多官能团环氧化合物交联HA，交联密度可达每1000 个HA 双糖重复单元至少有5 个交联的重复单元。与未交联HA 相比，这种交联物更能抵抗透明质酸酶的降解。

1.1.2 醛交联

醛类是常用的交联剂之一。HA 和双醛的交联反应被认为是通过形成缩醛和半缩醛基团而完成的［6］。HA 可以和戊二醛(GTA)发生化学交联形成非水溶性膜［9］。然而，利用GTA 进行交联制得的生物材料易引起钙化并且毒性高，这主要是由于无法完全除去产物中残留的GTA 所致。Ramires 等采用GTA 蒸汽做交联剂，制备了交联聚乙烯醇-HA 膜。使用GTA 蒸汽对HA 进行交联被认为是一种有效的避免交联剂残留的方法［10］。

1.1.3 砜交联

HA 与二乙烯基砜(DVS)可在碱性水溶液中发生交联反应制得凝胶。DVS 交联的凝胶具有高度生物相容性、非抗原性以及非免疫原性，力学性能也得到大幅提高，可用作组织工程的支架材料［11］。Sannino 等［12］利用DVS 交联HA 和纤维素衍生物制备了具有微孔结构的水凝胶。该水凝胶对外部吸收媒介组分的变化很敏感，平衡吸收量比普通HA 凝胶高，有可能用于预防术后软组织粘连。

1.2 羧基交联

1.2.1 碳二亚胺(EDC)交联

在酸性条件下，HA 与EDC 可发生交联反应［13，14］。常用的EDC 交联剂包括单碳二亚胺和双碳二亚胺。EDC 交联得到的HA 膜密度大、结构刚性强，因而抗透明质酸酶降解的能力得以增强［15］。Lu 等［16］对EDC 和GTA 交联的HA 凝胶进行了对比，发现EDC 交联的HA 凝胶膜的抗拉伸能力更高，表面也更光滑、细胞毒性更小。Lai 等［17］研究了EDC 交联的HA 凝胶在鼠眼前房中的生物相容性发现，与GTA 交联的膜相比，这种凝胶膜具有更好的眼部生物相容性。EDC 催化HA 交联可制备具有不同形态的衍生物，如薄膜、凝胶和纤维，可用于载体或者组织工程支架的材料等，具有结构稳定、力学强度高、透明、细胞相容性好的特点。EDC 交联HA 还有其显著的优点:EDC 本身并不进入到最终产物中，仅作为交联反应的催化剂;EDC 作为交联剂细胞毒性小，后处理比常用的戊二醛简单。

1.2.2 酰肼交联

酰肼类化合物也是比较常用的交联剂，酰肼的氨基与HA 的羧基可发生交联反应［18］。经过酰肼交联的HA 凝胶柔软性、流动性和溶解性降低，力学性能则有明显的提高。常用的酰肼包括单酰肼、二酰肼和多酰肼。二酰肼和多酰肼连接到HA 分子上后，酰肼多余的氨基不仅可以与HA 分子的其它羧基反应，发生分子内或者分子间交联，或者和其他小分子或聚合物发生交联反应，而且还可用于挂载药物，从而可作为药物载体［18］。此外，HA 与单酰肼和多酰肼反应可制备生化传感器以及具有生物相容性的组织工程支架，还可用作防术后粘连的原位交联凝胶的前体［19］。Motokawa 等［20］制备了一种新型的可持续释放红细胞生成素(EPO)的HA 凝胶。Luo等［21］先将HA 转化成己二酸二酰肼衍生物，再用带双官能团的聚乙二醇-丙二醛作交联剂制备出了可在几秒内迅速膨胀、水化后柔软的凝胶干膜。Shiseido 公司［22］用二酰肼交联浓缩的HA，制备出不溶于水的HA 凝胶。该HA 凝胶在一定交联度内是透明的，具有细胞毒性小、弹性适中、稳定和生物降解性高的优点，可注射进人体，并支持药物释放体系。

1.2.3 二硫化物交联

Shu 等［23］采用二硫基丙二酰肼(DTP)和二硫基丁二酰肼(DTB)作为交联制备了硫醇改性的HA 凝胶。Liu 等［24］采用Shu 等［23］的方法制备了二硫化物交联的HA 膜并发现这种膜具有良好的细胞相容性，体外降解也很慢。

1.3 氨基交联

HA 在交联前先进行化学改性可形成其它化学反应基团。比如，HA 用酸或碱处理可导致部分N-乙酰氨基中的乙酰基脱乙酰化而形成自由的氨基。这种自由的氨基可大大拓展HA 结构修饰的途径和方法。利用HA 脱乙酰基化后的游离氨基可进行交联改性制备交联产物［25，26］。京尼平(Genipin)是一种新型的交联剂，可由传统中药杜仲的活性成分京尼平甙中水解得到，也可人工合成［27］。Genipin 可自发地与氨基发生反应，生成一个环烯醚萜氮化物，随后经过脱水作用，形成一个芳香族单体，该单体可经由自由基反应形成环状的分子间和分子内交联结构［28］，用其交联脱乙酰化HA 可制备环状交联的HA。Genipin 广泛应用于生物制品中，但是也有其缺点，如其与氨基反应过程中，会生成一种深蓝色的色素，限制了其在制备浅色、透明等产品中的应用，并且其价格也比较昂贵。

1.4 内部酯化交联

HA 内部酯化衍生物是由HA 本身的羟基和羧基以分子内和分子间交联的方式得到的。由于是通过内部反应得到，因此未引入外来分子。这种自交联透明质酸(ACP)凝胶是完全生物相容的，体内驻留时间长，力学性能也得以改善［29］。Belluco 等［30］测试了ACP 凝胶的抗粘连作用，发现ACP 凝胶在1%浓度时就能防止腹部术后粘连。Pellicano 等［31］研究了ACP 凝胶在预防腹腔镜子宫肌瘤剔除术后粘连的效用，发现ACP 确可作为潜在的防术后粘连剂。

2 非交联改性

2.1 酯化改性

HA 的酯化改性在其羧基或羟基上进行的，通过部分和全酯化反应，可改善HA 的理化性质和生物功能，提高稳定性、溶解性。酯化HA 可通过挤出、冷冻干燥或者喷雾干燥而制成具有不同功能活性的材料，如薄膜、纤维、海绵、微球等。这类新型材料有望用于临床的各个领域。此外，酯化类型和酯化程度也可影响这些材料的物理化学性质及生物特性［32］。

2.1.1 羟基酯化

丁酸盐［33-35］能够抑制人体肿瘤细胞生长，但其半衰期短，易经代谢排出体外。Speranza 等［36］通过丁酸和HA 的酯化反应制备了新型组蛋白脱乙酰基酶阻聚剂(HA-But)。含HA 的靶向药物能够聚集于表达CP44 的细胞表面并通过内容作用进入细胞［37］。研究表明，HA-But 是一种潜在的细胞靶向抗肿瘤剂，可用于治疗原发性和转移性肿瘤。最近发展的“生物打印机(bio-printer)”为解决器官移植带来了希望［38］。生物打印机的“墨水”是细胞聚集体或者多细胞的合成细胞外基质，“纸”是可为“墨水”提供支架或者基质的聚合物。Skardal 等利用甲基丙烯酸化的透明质酸(HA-MA)和明胶的甲基丙烯酸乙醇酰胺衍生物(GE-MA)，采用两步光交联技术制备了HA-MA/GE-MA 凝胶。这种光交联生物材料解决了组织工程中打印凝胶来源不足的问题［39］。

2.1.2 羧基酯化

紫杉醇是一种重要的抗肿瘤药物，但单独应用时具有很多缺点，如溶解性低、有一定毒性等［40］。为了克服这些缺陷，Lee［41］等制备了HA-紫杉醇化学轭合物，以获得更好的药物溶解性、稳定性、靶向性和控释性。商品化的紫杉醇通常用蓖麻油/乙醇作为溶媒以增加其溶解性，但是也因此产生了很多副作用［42］。Rosato 等［42］制备了一种新型的水溶性紫杉醇-HA 结合物，由HA 的羧基和紫杉醇通过酯化反应合成。和传统的紫杉醇相比，其水溶性大幅提高。

2.2 接枝改性

HA 的接枝反应是将小分子物质或聚合物接枝到HA 主链上。所形成的聚合物作为药物载体，可充分利用HA 与细胞表面受体CD44 或其它HA 受体蛋白的结合能力，达到药物靶向运送的目的。Huang 等［43］将低分子量琼脂糖用表氯醇激活后和HA 接枝合成了琼脂糖接枝的透明质酸(Ag-g-HA)，可作为胰岛素释放载体。Cho 等［44］利用EDC 和N-羟基琥珀酰亚胺做偶联剂，将末端带氨基的泊洛沙姆接枝到HA 上用于眼部药物的载体。Pitarresi等［45］将HA 接枝到聚乳酸(PLA)和聚乙烯乙二醇(PEG)上，研制了自组装两性分子HA 接枝共聚物来包裹抗肿瘤药物。Varghese 等［46］合成了一种新型胍基化试剂，并用其改性HA 制备非病毒性基因/siRNA 传递载体。Di Meo 等［47］通过点击化学合成了两种带有碳硼烷的新型HA 衍生物，用于硼中子捕获疗法。Oldinski 等［48，49］将HA 与高密度聚乙烯(HDPE)接枝共聚，制备了有望用于组织修复的高分子共聚物材料。

2.3 疏水改性

Zhang 等［50］通过甲硅烷基化反应合成了一种新型HA 衍生物，增加了HA 的疏水性，增强了其在普通有机溶剂中的溶解性。Lapcik 等［51］也对HA 进行了疏水改性，结果显示烷基化HA 大分子流变学性能有了明显的改变。Charlot 等［52］合成了分别带有β-环糊精和金刚烷的透明质酸支化衍生物。此两种物质在水溶液中可以形成新型的“主-客”超分子自组装复合物，并且表现出显著的粘弹特性。

3 复合改性

3.1 与其它多糖复合

稳定蛋白质最常用的方法是冻干法，但是这种方法对蛋白质的结构和再水化后的活性具有不良的影响。Zhang 等［53］发现HA-海藻糖复合物是稳定胰激肽原酶(PKase)的有效辅料。Majima 等［54］制备了壳聚糖(CS)和HA 复合物，用做韧带和肌腱组织工程支架材料。CS 和HA 还可通过离子作用自发形成纳米粒子载体，包裹大分子药物肝素，用于肺部释药［55］。临床上，多佐胺(DH)和噻吗洛尔(TM)可用于青光眼的治疗，但其具有生物利用度低、药物接触时间短等缺点。Wadhwa 等［56］用HA/CS 纳米粒子(CS-HA-NPs)装载TM 和DH，与不含HA 的CSNPs 相比，CS-HA-NPs 造成的眼内压力显著下降，粘着强度和效率有大幅提高，更能满足眼部释药载体的要求。Tan 等［57］将HA 引入壳聚糖-明胶(CSGel)体系，制成CS-Gel-HA 复合材料。这种复合材料可有效地缩短细胞在支架材料表面的适应期，抑制材料表面细胞的凋亡。

3.2 胶原蛋白复合

胶原蛋白是细胞外基质的一种主要结构蛋白，支持多种不同组织的生长，与HA 复合能赋予它良好的力学特性。Park 等［58］制备了经EDC 修饰的HA-胶原蛋白复合薄膜，该膜与用戊二醛作交联剂制得的膜相比，对酶解的抵抗力大幅提高，含水量高达98%，无明显细胞毒性，可用于组织工程中三维细胞培养的支架。

3.3 与聚乳酸-羟基乙酸共聚物(Poly lactic-co-glycolic acid，PLGA)复合

PLGA 是一种获美国FDA 批准可应用于人体的高分子合成材料［59］，具有良好的生物力学强度，容易加工，而且药物控释可持续几天到几个月，已广泛用于组织工程支架等领域［60］。将HA 固定到多孔、可降解的PLGA 支架的表面，制成HA 改性的PLGA支架，可增强软骨组织中软骨细胞的粘附、增殖和分化［61］。

3.4 与超高分子量聚乙烯(UHMWPE)复合

UHMWPE 由于具有优良的机械性能、生物相容性和化学稳定性，因此在临床上被用作人工关节软骨-关节臼材料。但是此材料的抗磨性并不理想，在应用过程中会不断产生微米尺寸磨屑，影响使用效果和寿命。Zhang 等［62，63］通过将UHMWPE 与硅烷化的HA 复合制备了一种微复合材料。经实验测试，此种新型材料与不添加HA 的UHMWPE 聚乙烯材料相比最高可降低56%的磨损。

4 结论与展望

自从1934 年HA 被首次发现和制备以来，经历了近八十年的研究与开发，人们对其结构、理化性质、生物功能已有了相对较明确的认识。随HA 市场需求的与日俱增和临床应用的推广，针对不同用途的HA 及其改性衍生物的需求正不断增大。目前，HA 研究和开发已成为材料学、生物学、病理学、免疫学、临床医学及生物组织工程学等多学科领域研究的热点。HA 由于其独特的理化性质和生理功能将得到更广泛的应用。

众多学者对HA 进行了物理改性和化学改性，在一定程度上克服了其易降解，在组织内停留时间短的缺点。以HA 为基础的凝胶具有高度生物相容性，而且加工制备容易，因此这种材料在医学上会有很大的应用潜力。在非高力学强度要求的应用领域，HA 凝胶材料已显示出独特的综合性能优势。但力学稳定性对组织工程材料而言十分重要，迄今为止还不能获得具有满意力学强度的HA 凝胶以适应各种应用需求。多糖基水凝胶在要求材料具有高韧性和抗疲劳性能的动态加载环境下仍处于劣势。如何获得完全无细胞毒性、高力学强度的HA 凝胶材料仍然是努力目标。相信未来一些年，HA 交联产物及其衍生物的开发及应用将得到进一步地重视，HA 研究特别是交联改性还会有更快、更深入的发展。

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