活性氧物质和超氧化物歧化酶与稽留流产的关系

朱丽均 陈亚萍 陈炳锦 梅小会

（复旦大学附属上海市第五人民医院妇产科，上海 200240）

活性氧物质和超氧化物歧化酶与稽留流产的关系

朱丽均 陈亚萍 陈炳锦 梅小会

（复旦大学附属上海市第五人民医院妇产科，上海 200240）

目的:探讨绒毛组织中活性氧物质（reactive oxygen species，ROS）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）与稽留流产的关系。方法:选取稽留流产患者20例作为研究组，同时选取正常早孕要求流产者20例作为对照组。研究组胚胎稽留宫内时间小于4周。采用流式细胞仪和化学发光分析法检测所有患者绒毛组织中ROS和SOD的水平。结果:与正常早孕女性相比，稽留流产患者绒毛组织中ROS水平显著增高（P＜0.05），SOD水平显著降低（P＜0.05）。结论:绒毛组织中ROS和SOD的平衡失调可能是导致稽留流产发生的重要因素。

活性氧物质； 超氧化物歧化酶； 稽留流产； 流式细胞仪； 化学发光分析法； 绒毛

稽留流产是指胚胎或胎儿已死亡，但其滞留在宫腔内尚未自动排出，稽留流产的患病率在育龄期女性中可达15%～20%［1］。目前对于稽留流产尚无有效的预防措施，这是因为对它的发病机制尚未完全明确。研究［2］发现自然流产与胚胎组织超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性降低有关，SOD是一种氧自由基清除剂，据此推测稽留流产可能与胚胎细胞活性氧物质（reactive oxygen species，ROS）的生成和抗氧化防御系统之间的平衡失调有关。因ROS的化学性质极为活泼，所以目前都是通过测定丙二醛等间接指标来反映体内ROS水平［3］。本研究通过直接检测ROS和SOD在稽留流产患者绒毛组织中的水平，探讨两者与稽留流产的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2010年1月—2011年12月在我院住院的经B超和血绒毛膜促性腺激素β亚单位（human chorionic gonadotropin－β，β－HCG）动态监测证实为稽留流产的患者20例作为研究组（均无流产相关原因）。选取同期经B超证实胚胎存活且要求行人工流产的早孕女性20例作为对照组。研究组患者平均年龄（29.87±5.07）岁，平均孕产次（2.71±1.34）次；对照组平均年龄（26.66±5.33）岁，平均孕产次（2.51±1.21）次。两组女性胚胎停止发育的平均时间为停经7～9周。对照组与研究组的年龄、停经孕周及孕产次均无显著差异（P＞0.05）。

1.2 入组标准

研究组B超检查结果显示胚胎未见原始心管搏动，血β－HCG呈下降趋势（分别于首次就诊日、3 d后、6 d后检测3次）。对照组孕龄不超过12周，术前B超检查结果显示孕囊形态及胚胎原始心管搏动正常。两组女性既往均无妊娠并发症、内外科合并症、感染、自然流产、早产、死胎和先兆流产等病史以及服药史。

1.3 标本的采集与处理

无菌条件下，采用负压抽吸方法吸取绒毛组织。取绒毛组织0.05～0.5 g，以0.9%氯化钠液漂洗直至血块洗净，吸干水分并称取质量后取部分组织立即检测ROS，将其余绒毛组织迅速放于液氮罐中待测SOD。

1.4 实验方法

（1）ROS检测:取绒毛组织0.05 g，加入0.9%氯化钠液约450μL，用组织匀浆器匀浆；用吸管吸取组织匀浆，经100目尼龙网过滤到试管内；1000 r/min离心4～5min；再用0.9%氯化钠液洗3次，每次以500～800 r/min离心以去除细胞碎片；以300目尼龙网过滤去除成团细胞，得到单细胞悬液；取1m L单细胞悬液用流式细胞仪进行ROS检测。2’，7’－二氯荧光乙酰乙酸盐（DCFH－DA）是一种能完全自由通过细胞膜的染色剂，其一旦被氧化，便产生荧光二氯荧光素（DCF）。根据以上原理，测得的DCF荧光强度越强，说明ROS的含量越高；（2）SOD活力测定:取胚胎组织0.05 g，加9倍体积的0.9%氯化钠液，低温条件下使组织匀浆化，匀浆以2000 r/min离心5 min，取其上清液，用黄嘌呤－黄嘌呤氧化酶反应系统以化学发光分析法测定SOD活力。所用试剂由上海碧云天生物技术研究所提供。

1.5 统计学处理

采用SPSS13.0软件进行统计学分析。各项测定值以均数±标准差±s）表示，检验方法采用方差齐性检验及t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 绒毛组织中ROS的水平

研究组DCF荧光强度与对照组比较显著升高（P＜0.05），见表1。

表1 研究组与对照组绒毛组织中ROS的水平

2.2 绒毛组织中SOD的水平

研究组SOD酶活力单位与对照组比较显著降低（P＜0.05），见表2。

表2 研究组与对照组绒毛组织中SOD的水平

3 讨 论

3.1 ROS与SOD的作用

ROS又称反应性氧类物质，包括处于自由子状态的氧和不属于自由基的过氧化氢。细胞内同时存在生成ROS的体系和拮抗其生成的抗氧化剂体系。SOD是体内的重要金属酶抗氧化剂，催化超氧化物阴离子发生歧化作用，生成过氧化氢和分子氧，破坏自由基，防止氧毒性。正常少量生成的ROS会被SOD、谷胱甘肽过氧化酶、过氧化氢酶及维生素E等细胞内外抗氧化剂清除。在缺氧、缺血、化学性放射性损伤、炎性反应以及老化等的氧化还原过程中，ROS生成增多，使脂质、蛋白质和DNA过氧化，分别引起双层脂质膜的稳定性下降、DNA单链破坏与断裂并促进含硫蛋白质的相互交联。ROS的强氧化作用是细胞损伤的基本环节，ROS和SOD的平衡失调与许多疾病密切相关。

3.2 ROS、SOD 与妊娠的关系

研究［4］显示妊娠时ROS增多，但同时抗氧化剂如SOD等亦增多，使得氧化和抗氧化在新的水平上得以维持，妊娠得以继续。

3.3 ROS、SOD与稽留流产的关系

本研究显示，稽留流产患者绒毛组织中ROS的水平显著高于正常早孕女性，而SOD的水平却显著低于正常早孕女性，这提示稽留流产患者存在ROS生成和抗氧化防御系统之间的失衡，使细胞内氧化还原状态发生改变。其可能的机制为:一方面ROS的增加改变了胚胎细胞内的氧分压，而高氧状态抑制了SOD的生成，导致细胞内氧化还原状态重度失衡，从而导致胚胎停止发育，发生稽留流产；另一方面胚胎滋养层细胞未充分在低氧环境中发育即提前进入缺血再灌注过程，产生过多的ROS，形成恶性循环，从而促进了稽留流产的发生。

本研究从氧化和抗氧化失衡角度初步探讨了ROS和SOD与稽留流产的相关性，为进一步研究稽留流产的发病机制及预防提供参考。

［1］Beucher G，Beillat T，Dreyfus M.Management of first trimester miscarriages［J］.J Gynecol Obstet Biol Reprod（Paris），2003，32（1）:5－21.

［2］El－Far M，El－Sayed IH，El－Motwally AE，et al.Serum levels of TNF－alpha and antioxidant enzymes and placental TNF－alpha expression in unexplained recurrent spontaneous miscarriage［J］.J Physiol Biochem，2009，65（2）:175－181.

［3］马秀菊，肖文霞.氧化应激与自然流产的相关性研究［J］.中国妇幼保健，2007，5（22）:622－623.

［4］Burton GJ，Jauniaux E.Oxidative stress［J］.Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol，2011，25（3）:287－299.

Reactive Oxygen Species and Superoxide Dismutase Were Correlated with Missed Abortion

ZHU Lijun

CHEN Yaping CHEN Bingjin MEI Xiaohui Department of Gynaecology and Obstetrics，Shanghai Fifth People’s Hospital，Fudan University，Shanghai 200240，China

Objective:To study whether reactive oxygen species（ROS）and superoxide dismutase（SOD）in placental villous tissue were related with missed abortion.Methods:Twenty patients with missed abortion（study group）and twenty early pregnant women undergoing abortion surgery（control group）were enrolled in this study.In patients with missed abortion the time embryos stayed in uterus after they died was less than four weeks.Fluorescent staining method and chemiluminometry were used to detect the levels of ROS and SOD in placental villous tissue.Results:The level of ROS in the study group was significantly higher than that in the control group（P＜0.05），while the level of SOD in the study group was significantly lower than that in the control group（P＜0.05）.Conclusions:The imbalance of ROS and SOD in placental villous tissue may be an important cause of missed abortion.

Reactive oxygen species； Superoxide dismutase； Missed abortion； Flow cytometry； Chemiluminometry；Villi

R714.2

A

上海市闵行区自然科学研究课题资助项目（编号:2009MHZ088）