实时荧光定量PCR技术在人类细小病毒B19检测中的应用

上海浩源生物科技有限公司 疏 翠 安 顺

人类微小病毒B19（Human parvovirus B19，HPV B19）是儿科常见的出疹性疾病——传染性红斑（又称第五病，Erythema infection，EI）的病因。除了这一轻型自限性感染外，B19 病毒还可使慢性溶血病病人发生再障危象及急性多关节病。在免疫缺损病人中可造成持续性感染。由于细小病毒B19致病的广泛性和复杂性，目前国际上对该病毒的研究比较活跃。B19 可通过呼吸道传播，也可通过输血和使用血液制品传播，从而引起多种疾病。B19病毒的近期感染主要通过IgM抗体的检测，常用捕获法或放射免疫测定，IgG 抗体对诊断急性感染无意义，其存在仅表明曾感染过，主要用于血清流行病学调查。目前实验室和临床检测中，最敏感检测病毒的方法是PCR法，通过对B19进行实时荧光定量PCR检测，能突破窗口期的局限性，更利于B19 病毒的早期诊断和治疗。本文，笔者根据荧光定量PCR的原理建立了人类细小病毒B19的实时荧光定量PCR检测方法，经过对临床样本的检测，显示建立的方法敏感性高，特异性好，适合B19病毒的筛查和核酸定量检测。

一、材料与方法

1.标本来源。WHO B19 标准品购自英国国家生物制品检定所（NIBSC）。单纯疱疹病毒样本、巨细胞病毒样本、带状疱疹病毒样本、T细胞白血病病毒样本、腺病毒样本、呼吸道合胞病毒样本、流感病毒样本和副流感病毒样本来自上海地区医院。89份临床样本为血液中心献血员血浆留样中筛检到的B19阳性样本。

2.试剂和仪器。DNA 提取采用上海浩源磁珠提取试剂盒，dNTP（dATP、dCTP、dGTP、dUTP、dTTP）和Tris 为宏锦公司采购，尿嘧啶糖基化酶（UNG）为roche 公司产品、热启动TaqDNA 聚合酶购自Fermentas 公司。pMD18-T 试剂盒试剂盒购自Takara。DNA1000 微流芯片试剂盒购自Agilent。artus® Parvo B19 RG PCR Kit 购自QIAGEN 公司。实验仪器为TBG Ezbeads-system32 核酸提取仪、Agilent Stratagene 安捷伦Mx3000P 荧光定量PCR仪和Agilent Caliper 2100微流芯片仪。

3.引物探针的设计及合成。从NCBI 上下载B19 核苷酸序列，运用计算机DNAMAN、Oligo、Primer 5 软件自行设计引物和探针。B19 引物在结构蛋白VP1、VP2 均有保守序列，但是VP1较好，选取PA57634BR/1995 上VP1 保守序列为检测片段，设计引物和探针：上游引物5’-GGGCCAAT TGGAGGTATTAAATC-3’，下游引物5’-CCACCGTCCTGTAGCTTTACG-3’，探针5’-Fam-TA CT A CCTTAGTTCAGTATGCTGTG-BHQ1-3’。扩增片段长度为117bp。

4.样本B19 DNA的提取。采用上海浩源磁珠提取试剂盒提取纯化样本中的B19 DNA，样本用量200 uL，提取过程在TBG Ezbeads-system 32核酸提取仪上自动化进行。操作严格按照说明书进行。

5.实时荧光PCR扩增检测。实时荧光PCR扩增总反应体积为60 μL，其中模板为20 μL，热启动Taq酶为2U，尿DNA糖基化酶（UNG）0.2U，1×PCR 缓冲液，引物各为30 pmol，探针为15 pmol，200 μmol/LdNTP，5.0 mmol/L MgCl2。反应条件为：37 ℃UNG 酶反应2 min；50℃UNG 酶灭活5 min；94 ℃预变性10 min；（94 ℃变性10 s；55 ℃退火35 s；65 ℃延伸35 s）×45个循环；荧光信号层设定为FAM荧光素，荧光信号采集设定在最后一步的65 ℃。PCR 过程在Agilent Stratagene 安捷伦Mx3000P 荧光定量PCR仪上进行。

6.PCR 产物的鉴定。将PCR 产物用Agilent Caliper 2100 微流芯片仪进行检测，分析产物片段的大小。然后再将PCR 产物进行2%的琼脂糖凝胶电泳，然后将包含目的核酸片段大小的琼脂糖切胶后用磁珠法进行纯化，将纯化后的扩增产物测定浓度后，用Takara的pMD18-T试剂盒将其与载体pMD18-T物质的量之比3:1 的比例在T4 连接酶的作用下进行连接反应，构建重组质粒pMD18-T-VP1。用CaCl2 化学转化pMD18-T-VP1 至大肠杆菌JM109感受态细胞中，用蓝白斑筛选阳性转化菌，提取重组质粒，酶切，选择阳性克隆菌进行测序。

7.定量标准曲线的建立。将提取的阳性重组质粒用Qiagen公司的B19核酸定量检测试剂盒进行标定。将B19 WHO标准品（5×105IU）加水500 uL溶解，得到1×106IU/mL，然后用PBS稀释成1×106IU/mL、1×105IU/mL、1×104IU/mL、1×103IU/mL共4个梯度，用WHO标准品用Qiagen公司的B19核酸定量检测试剂盒共同检测稀释好的B19标准品和B19阳性质粒，以WHO标准品作为标准曲线标定得到B19 阳性质粒的浓度。标定好的质粒用PBS稀释到1×107IU/mL、1×106IU/mL、1×105IU/mL、1×104IU/mL、1×103IU/mL 共5 个梯度，用建立的检测体系进行提取扩增作为标准曲线。

8.特异性检测。采用磁珠提取试剂盒提取单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、带状疱疹病毒、T细胞白血病病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒和副流感病毒样本中的病毒核酸，用建立的PCR系统进行扩增检测。

9.灵敏度检测。将B19病毒的WHO标准品用用正常人血清稀释到250 IU/mL、100 IU/mL、50 IU/mL、25 IU/mL、10 IU/mL，然后用建立的荧光PCR病毒核酸检测系统对每个浓度梯度分别检测30次，检测结果用PROBIT进行统计分析，确定检测体系的分析灵敏度。

10.临床样本的检测。将研制的B19核酸定量检测系统与美国QIAGEN 公司的artus®Parvo B19 RG PCR Kit 共同对89 份临床标本进行检测，通过数据分析，比较两个检测系统的相关性。

二、结果

1.PCR 扩增产物微流芯片结果。B19 感染血液样本DNA 经核酸提取和PCR 扩增后，采用Agilent Caliper 2100 微流芯片仪进行检测，结果显示扩增片段大小约为117bp，与设计的目的片段大小一致，检测结果如图1所示。

图1 B19PC R 产物微流芯片检测结果

2.重组质粒pMD18-T-VP1 测序结果。将扩增得到的PCR产物克隆测序后，blast分析显示序列和GENEBANK的同源性达93%～100%。

3.定量标准曲线的建立。用B19WHO标准品标定好的质粒用PBS 稀释到1×107IU/mL、1×106IU/mL、1×105IU/mL、1×104IU/mL、1×103IU/mL、用建立的检测体系进行提取扩增，在结果分析中把对应的孔类型设定为standard，然后把对应的核酸含量填写进去，分析后软件自动生成标准曲线，标准曲线方程为Y=-3.161*LOG（X）+40.60，相关系数RSq=1.000，扩增效率Eff.=107.2%，如图2所示。

图2 B19阳性质粒建立的标准曲线

4.特异性检测。用磁珠提取试剂提取疱疹病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒和副流感病毒样本的核酸，PCR系统扩增模板，结果只有B19样本样本有扩增曲线，其他样本均为产生扩增曲线。

5.灵敏度检测。将B19病毒的WHO标准品用正常人血清稀释到250 IU/mL、100 IU/mL、50 IU/mL、25 IU/mL、10 IU/mL，每份样本取200 uL，用磁珠提取试剂盒进行核酸提取，取提取的模板40 uL，采用PCR 系统进行扩增，结果显示系统灵敏度可以到49.16 IU/mL。见表1。

6.临床样本的检测。将研制的B19 核酸定量检测系统与美国QIAGEN公司的artus® Parvo B19 RG PCR Kit共同对89份临床标本进行检测，通过数据分析，得出两个检测系统所得数值具有显著相关性。相关方程为FQ=1.0285×QIAGEN+0.42（n=89），r=0.9785，P〈0.001，结果如图3所示。

表1 B19病毒分析灵敏度检测结果

图3 B19核酸定量检测系统与Q IA G EN公司产品临床检测相关性

三、讨论

B19 病毒为单链DNA 病毒。目前，多采用血清学B19 抗体和抗原的检测，但是检测B19病毒抗体起初是采用血源抗原，但该抗原来源困难，难于普及和推广。荧光定量PCR，因采用荧光标记的探针杂交或直接使用能和双链DNA 结合的荧光素检测PCR扩增产物，进一步提高了检测的敏感性和特异性。

由于B19具有高度保守性，本文，笔者选择其基因组高度保守区域为扩增靶区域，设计特异性引物和荧光探针，对提取后获得的模板进行B19 DNA 扩增。扩增过程中Taq DNA 聚合酶5’-3’外切酶活性切割反应系统中带荧光标记的TaqMan探针，随着PCR反应的进行，荧光信号不断积累。实时荧光定量PCR仪通过检测达到和超过荧光阈值的信号给出样品的阴阳性结果。由图2可以看出，不同梯度定量模板数的对数值与CT值之间具有很好的相关性，其相关系数为1。同时，建立的检测方法采用了含有UNG-dUTP 抗污染系统，UNG 酶特异识别扩增产物中U-DNA片段中的UTP的位点并进行切割，从而有效防止了PCR扩增产物的污染。

对于B19核酸的提取纯化笔者采用了近年迅速发展且被广泛应用的磁珠法核酸提取。磁珠是以纳米级磁性材料（如三氧化二铁、四氧化三铁、铁钴合金等）为载体，外面包裹高分子骨架材料并经各种不同的物理化学方法处理后制备成磁性微球，该磁性微球可以在高盐环境下实现对核酸分子的吸附，而在低盐环境下又可以方便地把吸附的核酸释放到缓冲液中。

通过对B19病毒WHO国际标准品的检测，建立的方法的分析灵敏度达到了49.16 IU/mL，同时检测系统与相关病毒样本无交叉反应，特异性良好。与美国QIAGEN 公司的artus® Parvo B19 RG PCR Kit共同检测临床样本，结果显示两种方法有很好的相关性。