多器官功能障碍综合征小鼠巨噬细胞移动抑制因子释放对单核细胞免疫相关指标的影响

涂 玲 梁颖红 刘 佳 张俊华 魏 明 杜 英 (郑州大学基础医学院，河南 郑州 450052)

本研究旨在观察多器官功能障碍综合征(MODS)小鼠在病程不同阶段血清巨噬细胞移动抑制因子(MIF)含量的变化、反映免疫状况的外周血单核细胞MHC-Ⅱ类分子(IAb)表达规律及T淋巴细胞亚群的变化，分析MIF释放量的变化与单个核细胞免疫功能相关指标异常的关系，初步认识MODS发生、发展中MIF释放的规律及其对细胞免疫功能的影响。

1 材料与方法

1.1 动物分组及动物模型 6～8周龄雄性C57BL/6小鼠100只，体重20～25 g，郑州大学实验动物中心提供。动物适应性饲养1 w，饲以标准食物。实验前12 h禁食，自由饮水。动物随机分为正常组，酵母多糖致伤后 3、8、12 h 和伤后 1、2、3、5、12 d共9组。采用腹腔注射无菌酵母多糖的方法制作MODS模型〔1〕。实验组动物腹部皮肤常规消毒后，无菌注射酵母多糖悬液(2.5 g/100 ml石蜡油，注射剂量1 g/kg体重)。

1.2 血清MIF含量 分别取各时间点动物血清24 μl加6 μl 5×凝胶加样缓冲液，混匀后100℃水浴5 min，离心后上样，12%分离胶电泳;转膜，免疫印迹:一抗为抗小鼠MIF多抗，二抗为HRP标记的羊抗兔IgG(北京中杉金桥公司)，稀释度分别为1∶3 000和1∶2 000。用化学发光法进行检测(Pierce公司)。

1.3 外周血单核细胞MHC-Ⅱ类分子(IAb)表达 取小鼠眼球血 100 μl，加入 FITC 标记 IAb 抗体5 μl，经裂解红细胞、避光孵育、固定后，用射门法在流式细胞仪(BD公司)上测定IAb阳性细胞数并计算其百分比。

1.4 外周血T淋巴细胞亚群的分析 从小鼠眼球取血100 μl，肝素抗凝;加入 FITC-CD4 抗体和 PE-CD8 抗体各 5 μl，混匀后避光孵育30 min;加入红细胞裂解液后再避光孵育8 min;室温离心(1 500 r/min，5 min);细胞沉淀加入0.1 ml 4%多聚甲醛和0.4 ml PBS吹打混匀;用射门法在流式细胞仪上检测FITC-CD4抗体和PE-CD8抗体标记的淋巴细胞并分别计数，计算CD4+/CD8+细胞比值。

1.5 统计学方法 采用Stata7.0软件分析，数据以s表示，均数比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 血清MIF含量的变化 正常组及酵母多糖致伤后3、8 h组血清未检测到MIF蛋白表达条带，12 h组血清可见MIF表达带，表达量为(0.63±0.19)ng/ml，1 d组表达量最多，为(1.43±0.28)ng/ml，随后逐渐降低，5 d组未测到，但10 d组又增至较高水平，为(0.89±0.24)ng/ml。

2.2 外周血单核细胞IAb表达的规律 正常组外周血单个核细胞IAb表达量在30%以上;注射酵母多糖后8 h，外周血单个核细胞IAb表达量明显下降(P＜0.05);伤后2 d，IAb表达更少(P＜0.01)，伤后5 d IAb表达量有所恢复，但仍未达到正常组水平;伤后10 d，IAb表达再次下降，不足正常组的1/3(P＜0.01)，与5 d组比较也有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1 外周血单个核细胞IAb表达和T淋巴细胞CD4+/CD8+比值的变化(n=10，s)

表1 外周血单个核细胞IAb表达和T淋巴细胞CD4+/CD8+比值的变化(n=10，s)

与正常组比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01;与5 d组比较:3)P＜0.05

组别 IAb阳性率 CD4+/CD8+32.46±6.57 3.32±0.78 MODS组 8 h 18.56±4.821) 1.33±0.241)2 d 13.54±3.652) 1.07±0.212)5 d 24.78±6.14 1.82±0.431)10 d 9.87±2.782)3) 0.70±0.172)3)正常组

2.3 外周血T淋巴细胞亚群的变化 注射酵母多糖8 h组，CD4+细胞比例减少，而CD8+细胞比例增加，两者比值降低(P＜0.05);伤后2 d组，CD4+细胞比例降至最低，同时CD8+细胞比例也减少，两者比值仍在低水平(P＜0.01);伤后5 d，CD4+细胞比例增加，CD4+/CD8+细胞比值虽有增加，但仍低于正常组;伤后10 d，CD4+细胞比例再度减少，而CD8+细胞比例明显增加，CD4+/CD8+比值小于1。

2.4 血清MIF含量与CD4+/CD8+比值及外周血单核细胞IAb表达水平的关系 在病程早期的伤后12 h，血清MIF急剧升高，而此时CD4+/CD8+比值下降;伤后5 d进入缓解期，血清MIF水平降至接近正常，CD4+/CD8+比值也有所恢复;当进入第2次打击的伤后10～12 d时，血清MIF水平再度升高，并伴随CD4+/CD8+比值再次下降。

3 讨论

MIF不仅可抑制巨噬细胞的自由移动，参与迟发性超敏反应，还具有多种其他生物学作用。作为一种作用广泛的前炎症因子，MIF可参与宿主对微生物感染时发生的系列应激反应，能活化巨噬细胞，抑制其游走移动，增强其黏附、吞噬作用及杀灭肿瘤的活性。它是部分炎症性疾病中的关键介质，尤其在介导内毒素和脓毒症休克中起着关键作用。

本研究采用腹腔注射过量酵母多糖引起免疫反应过高和炎症反应迁延失控，进而诱发脓毒症，导致MODS〔1〕，其发展过程较好地模拟了临床MODS的所谓“双相打击”病程。研究结果显示，正常组动物血清未检测到MIF的存在;动物致伤后12 h，血清中MIF水平开始上升，伤后1～2 d达到高峰，随后下降，伤后10 d再次显著升高。这一规律与动物全身性炎症反应的程度及预后密切相关;血清MIF第一个高峰，动物处于过度炎症反应阶段，血清MIF来源于组织和外周血单核巨噬细胞分泌〔2〕，以及组织细胞损伤释放〔3〕;血清 MIF第二次升高时，动物正值MODS期，此时机体免疫机能低下，大量的组织细胞坏死，因此血清MIF的升高可能源自坏死细胞的释放〔4〕。血中大量的MIF将对血中和各组织器官中的免疫细胞和实质细胞产生广泛的影响〔5～9〕。

抗原提呈细胞表面MHC-Ⅱ类分子表达量的多少直接反映了其提呈抗原的能力，从而决定了T细胞的活化水平和免疫应答能力〔10〕。本研究提示MIF对MODS小鼠预后的影响与其抑制抗原提呈细胞MHC-Ⅱ类分子表达、抑制细胞免疫应答能力，导致免疫失衡有关。本研究结果表明，在MODS病程的早期采用抗MIF治疗，可以通过改善抗原提呈细胞的功能和T辅助细胞亚群的比例，调节机体免疫平衡，阻止免疫失衡的发生，进而阻止MODS的发生和发展。

有研究认为，MIF是通过抑制皮质类固醇激素对胞液IκB表达的上调对抗皮质类固醇等炎症因子的分泌，从而抵抗皮质类固醇激素在 NF-κB/IκB 信号转换通路中的效应〔6〕。NF-κB是普遍存在于免疫细胞胞液中的转录因子，可被炎症刺激(细胞因子、LPS、病毒)活化。当炎症刺激与其受体结合，即可激活细胞内一系列磷酸化反应，导致IκB分裂崩解，而IκB是一种阻碍蛋白，能阻碍NF-κB的释放。一旦 IκB崩解，NF-κB即释放活化，转移至胞核中激活炎症因子的转录。皮质类固醇激素通过与胞液中的受体结合为复合物，转移到核中，促进IκB的转录，从而抑制炎症介质的释放。而大量的IκB可限制NF-κB于胞液中，阻止炎症介质基因的表达。研究者在实验中运用LPS刺激人外周血单核细胞可引起胞液中IκB水平下降及核中NF-κB DNA结合力上升。在细胞培养液中加入生理剂量的泼尼松(50～200 ng/ml)可降低LPS的该种效应。即泼尼松可上调IκB的表达，抑制NF-κB。而当再加入1 ng/ml的MIF时则可抑制泼尼松的效应，使得胞液中IκB水平下降及核中NF-κB DNA结合力上升。在无LPS的情况下，MIF也同样可抑制泼尼松诱导的IκB的升高。说明了MIF抵消皮质类固醇激素的作用可能是阻止了泼尼松引起的IκB合成的增多，从而阻断了其对炎症因子表达的限制。

MIF是炎症免疫反应中的重要细胞因子，虽然近来已有一些研究证实了MIF在炎症反应中某些方面的作用机制〔11〕，还需要更多的研究去发现其完整的作用机制。一旦明确了MIF的作用机制，可有助于合理调节机体的免疫反应，在机体需要免疫反应时增强MIF的作用以杀灭病原菌，反应过度时则抑制其作用以防出现全身性炎症反应综合征，以抵抗疾病，维持机体健康，同时还可实现对皮质类固醇激素更合理的使用。

1 孙 宇，陆江阳，王晓虹，等.小鼠迟发性多器官功能障碍综合征模型复制及病理学观察〔J〕.中国危重病急救医学，2003;15(1):15-8.

2 Martin GS，Mannino DM，Eaton S，et al.The epidemiology of sepsis in the United States from 1979 through 2000〔J〕.N Engl Med，2003;348(16):1546-54.

3 Shapiro N，Howell MD，Bates DW，et al.The association of sepsis syndrome and organ dysfunction with mortality in emergency department patients with suspected infection〔J〕.Ann Emerg Med，2006;48(5):583-90.

4 Watson RS，Careillo JA，Linde-Zwirble WT，et al.Epidemiology of severe sepsis in children in the United States〔J〕.Am J Respir Crit Care Med，2003;167(5):695-701.

5 Bernhagen J，Calandra T，Mitchell RA，el al.MIF is a pituitary derived cytokine that potentates lethal endotoxaemia〔J〕.Nature，1993;365(6448):756-9.

6 Daun JM，Cannon JG.Macrophage migration inhibitory factor antagonizes hydrocortisone-induced increases in cytosolic I kappaB-alpha〔J〕.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2000;279(3):R1043-9.

7 Chagnon F，Metz CN，Bucala R，et al.Endotoxin induced myocardial dysfunction:effects of macrophage migration inhibitory factor neutralization〔J〕.Circ Res，2005;96(10):1095-102.

8 Al-Abed Y，Dabideen D，Aljbari B，et al.ISO-1 binding to the tautomerase active site of MIF inhibits its pro-inflammatory activity and increase survival in severe sepsis〔J〕.J Biol Chem，2005;280:36541-4.

9 Tadamichi Shimizu，Jun Nishihira，Hirokazu Watanabe，et al.Macrophage migration inhibitory factor is induced by thrombin and factor Xa in endothelial cells〔J〕.J Biol Chem，2004;279(14):13729-37.

10 Glimcher LH，Kara CJ.Sequences and factors:a guide to MHC class-Ⅱtranscription〔J〕.Ann Rev Immunol，1992;10(1):13-49.

11 张振辉，林碾仪，陈晓辉，等.巨噬细胞移动抑制因子在脓毒症小鼠心和肾组织中的表达〔J〕.中华急诊医学杂志，2009;12(1):68.