银杏叶提取物对血管性痴呆大鼠模型学习记忆及PSD-95表达的影响

王 宇 张明艳 王 燕 王 波 赵永才 (河北大学基础医学院，河北 保定 07000)

血管性痴呆(VD)是老年期痴呆的主要原因(约占80%)〔1〕，表现为高级神经活动的智能障碍，特别是认知功能障碍，如学习、记忆、思维等障碍，以及失语、失认等神经心理学症状、体征;重者需要依赖他人照顾，给家庭和社会带来巨大负担。VD模型的病理学研究显示，慢性低灌注导致神经元凋亡、缺失，导致突触数量减少，这可能是出现学习记忆障碍的原因之一〔2〕。有报道VD模型小鼠学习记忆能力下降可能与海马突触后致密物95(PSD-95)的表达减少有关〔3〕。近几年银杏叶提取物改善VD患者学习记忆的报道较多，但其具体机制不清楚。本文通过研究银杏叶提取物对大鼠海马PSD-95表达的影响，旨在探索其治疗VD的疗效及机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 采用纯种雄性Wistar大白鼠60只，体质量220～280 g(河北医科大学实验动物中心供给)。随机分为模型组，干预组，假手术组和正常组，每组15只。(1)模型组，制备VD大鼠模型;(2)干预组，制备VD大鼠模型，并在造模前5 d开始给予银杏叶提取物(100 mg/kg)，于清晨一次性注射给药，每日一次，直到处死前1 d;(3)假手术组，大鼠进行双侧颈动脉分离;(4)正常组，不做特殊处理。造模14 d后用水迷宫实验测定各组大鼠的学习、记忆功能，将大鼠断头取海马做下一步实验。

1.2 方法

1.2.1 VD模型制备 采用张丽香等〔4〕的方法，首先将大鼠用水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉后，大鼠仰卧固定于操作台，常规消毒后作约1 cm长的颈部正中切口，暴露并分离双侧颈总动脉，游离后置线，套活扣，拉紧丝扣，阻断血流10 min后松开，恢复血流灌注10 min，如此重复3次，同时在距离尾尖1 cm处剪断放血约1 ml后热凝止血;第三次再灌注后观察30 min，缝合切口。术后切口局部注射庆大霉素2 000 U，给予青霉素肌肉注射2 000 U/d，连续3 d观察大鼠存活情况，实验结束后大鼠全部存活。

1.2.2 试剂 凋亡TUNEL试剂盒购自瑞士罗氏公司，兔抗PSD-95抗体购自美国abcam公司，二喹啉甲酸(BCA)试剂盒购自美国Thermo公司，鼠抗3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)抗体购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2.3 Morris水迷宫实验 采用一个直径1.2 m、高0.5 m的圆桶，划为四个象限，盛水后按0.5% ～1.5%比例加入奶粉，使水成不透明乳白色，水温控制于22℃ ～25℃。将一直径10 cm的平台固定于某一象限，平台在水平面下1 cm。麻醉后16 d开始水迷宫实验。程序包括:①定位航行实验，历时5 d，每天上、下午各4次，将大鼠从4个入水点面向池壁放入水中，记录2 min内寻找平台的时间(逃避潜伏期);②空间探索试验，将鼠任选一入水点放入水中，测其2 min内在原平台处的停留时间。整个认知功能测试过程中，保持实验室内灯光、物品摆放等室内环境一致，以排除环境干扰。

1.2.4 组织取材、海马总蛋白提取与Western印迹的测定 反应认知功能测试完毕后大鼠快速断头，取出脑组织并分离海马。(1)提取海马总蛋白并用BCA法进行蛋白定量，其蛋白含量在5～8 mg/ml之间。(2)十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳:配制12%分离胶和5% 浓缩胶，每孔加样20 μl，电压110 V进行电泳。(3)转膜:恒流275A。(4)抗原抗体反应及显色。应用quantity one软件，以目的条带PSD-95与内参照GAPDH的平均光密度的比值表示PSD-95蛋白水平，进行半定量分析。

1.2.5 TUNEL法检测细胞凋亡 参照试剂盒说明书进行。

1.2.6 结果观察 用1%抗体稀释液替代兔抗PSD-95抗体进行阴性对照，反应呈阴性。在Olympus显微镜40倍镜下，利用Image-Pro Plus Version 5.0彩色图像分析系统计数TUNEL及PSD-95免疫阳性细胞数。

1.3 统计学方法 应用SPSS10.0统计软件进行分析，数据资料以s表示。

2 结果

2.1 行为学检测 水迷宫测试发现，模型组大鼠的逃逸潜伏期均明显高于假手术组(P＜0.05)，大鼠常在四个象限无目的漫游，寻找到平台的时间较长，经训练提高较慢，提示模型大鼠存在学习记忆障碍。与模型组相比，干预组大鼠逃逸潜伏期明显缩短(P＜0.05)，但仍长于假手术组(P＜0.05)。假手术组和正常组大鼠之间无显著差异，各组游泳速度无明显差异。见表1。

表1 各组大鼠游泳速度及逃逸潜伏期比较(s)

表1 各组大鼠游泳速度及逃逸潜伏期比较(s)

与模型组比较:1)P＜0.05;与假手术组比较:2)P＜0.05

组别 游泳速度(cm/s)逃逸潜伏期(s)模型组11.50±3.10 29.26±4.28 13.60±2.30 51.09±3.10干预组 12.60±3.10 39.14±6.101)2)假手术组 12.40±3.20 28.43±5.191)正常组

2.2 大鼠海马组织神经元凋亡情况 光镜下观察，TUNEL染色大鼠海马CA1及CA3区阳性凋亡神经元细胞核呈棕黄色，神经元体积缩小，呈三角形或扇形，尼氏小体消失。核固缩深染，核内染色质浓缩，染色质浓集于核周，呈新月形、环形甚至形成碎片。阴性神经元的核周围不显示黄色，神经元形态正常，较易区别。正常组和假手术组大鼠海马组织中只有零星凋亡神经元〔(4.26±1.38)%，(5.43±2.19)%〕，干预组〔(19.14±5.15)%〕有部分凋亡神经元，而模型组大鼠海马可见大量凋亡神经元〔(31.09±3.63)%〕，成簇出现，与假手术组及正常组相比有明显统计学意义(P＜0.01)，与干预组相比也有显著差异(P＜0.05)。

2.3 Western印迹分析银杏叶提取物对海马组织PSD-95蛋白表达水平的影响 模型组大鼠海马PSD-95蛋白明显降低，与假手术组比较差异显著(P＜0.01);干预组PSD-95蛋白明显增加，与模型组比较差异显著(P＜0.01)。见图1。

图1 Western印迹显示大鼠海马PSD-95蛋白表达水平

3 讨论

海马是与学习、记忆、情感等功能密切相关的重要脑皮层区，直接参与信息的存储和处理。海马神经元的存活数量直接影响神经元突触的可塑性效应，从而影响对信息的处理和传递〔4〕。有研究表明，脑神经元特别是海马组织对缺血极其敏感，极易引起神经元损伤凋亡〔5〕，其中海马CA1、CA3和门区的抑制性中间神经元是海马结构内最易受损的部位。因此海马组织神经元的大量凋亡丢失，可能是老年脑卒中患者发生VD的病理基础。

本研究表明，模型组大鼠海马组织存在大量神经元凋亡，虽然干预组大鼠海马组织亦有部分神经凋亡，但与模型组相比明显减少，表明银杏叶提取物可明显预防脑缺血诱导的海马神经元凋亡，减轻缺血对海马组织造成的损伤，甚至可以避免脑卒中患者发展为VD。中枢神经系统突触后膜细胞质面的PSD是突触后信号传导和整合的结构基础，密切参与突触功能的调节和突触后神经元对兴奋性刺激反应的调控，包含各种受体蛋白、锚定蛋白以及信号蛋白等，其中受体蛋白及其下游信号分子常结合于共同的锚定蛋白，组装为蛋白信号复合体，以利于突触后信号快速且特异性传递。PSD-95是该区域的锚蛋白，其主要功能为调节突触功能以及发挥突触和下游信号通路联系作用，并参与突触的功能和活性的动态调节;在缺氧引起神经元损伤病变中，也涉及到PSD-95表达改变〔6〕。

本研究发现，缺氧性脑损伤导致大鼠PSD-95表达降低同时大鼠学习记忆障碍，而其蛋白水平在干预组较模型组大鼠明显升高，提示PSD-95表达下调可能是诱导缺氧后VD发作的分子机制，海马PSD-95表达增多可能有助于降低大鼠VD的发生。银杏叶提取物可能通过影响神经元结构蛋白PSD-95表达来抑制神经元凋亡。

1 Gold G，Kovari E.Vascular dementia:big effects of small lesions〔J〕.Rev Med Suisse，2011;7(316):2190，2192-3.

2 Kawahara M，Konoha K，Nagata T，et al.Protective substances against zinc-induced neuronal death after ischemia:carnosine as a target for drug of vascular type of dementia〔J〕.Recent Pat CNS Drug Discov，2007;2(2):145-9.

3 Yao WD，Gainetdinov RR，Arbuckle MI，et al.Identification of PSD-95 as a regulator of dopamine-mediated synaptic and behavioral plasticity〔J〕.Neuron，2004;41(4):625-38.

4 张丽香，蔺心敬，李吕力，等.血管性痴呆大鼠海马神经元凋亡与乙酰胆碱含量变化〔J〕.中国老年学杂志，2009;29(24):3222-4.

5 McEwen BS.Physiology and neurobiology of stress and adaptation:central role of the brain〔J〕.Physiol Rev，2007;87(3):873-904.

6 Chen WF，Chang H，Huang LT，et al.Alterations in long-term seizure susceptibility and the complex of PSD-95 with NMDA receptor from animals previously exposed to perinatal hypoxia〔J〕.Epilepsia，2006;47(2):288-96.