大鼠脑部微透析实验中透析效率的研究

卢剑清，卢 嵩

（北京理工大学生命学院，北京 100081）

微透析技术是利用可溶性小分子可以自由穿透半透膜，而大分子物质被截留的特点，以一根微小的探针置于需要检测的组织部位，以一定速率向探针内灌注与组织内体液相似的等渗溶液，在探针顶端的半透膜处与体内小分子物质透过浓度梯度进行物质交换，从而使其进入透析液。这样通过收集透析液的方法并进行检测就可以实时反映生物体内小分子物质的情况[1,2]。

本文将微透析探针植入大鼠脑部黑质区，在透析液中加入一定浓度的多巴胺（Dopamine，DA）进行灌注，通过测定透析后透析液中的DA浓度，对研究微透析探针的透析效率进行了研究[3]。

1 材料

1.1 微透析实验

Wistar大鼠（200~300g，北京维通利华实验动物有限公司）；MAB6.14.1型微透析探针（瑞典MAB公司）；CMA402型微量注射泵、CMA/120 清醒动物活动装置、Univentor 820 微量低温分步收集器（瑞典CMA公司）；SN-1N型脑立体定位仪（日本Narshige公司）；牙科钻（韩国STRONG公司）；戊巴比妥钠（美国Amresco公司）；多巴胺（美国Sigma公司）自凝造牙粉（德国贺利氏公司）；NaCl、KCl、CaCl2、H2O2（分析纯，北京化工厂）；手术刀、止血钳、手术剪刀、手术镊子等（上海医疗器械厂）。

1.2 色谱分析

582型二元泵、542型自动进样器、5600A型库伦阵列检测器、6210型电极（美国ESA公司）；甲醇、乙腈（色谱纯，美国Thermo Fisher公司）；Discovery®HS F5柱(250 mm × 4.6 mm i.d., 5 μm，美国Supelco公司)、柠檬酸、Na2EDTA（美国Amresco公司）、Na2HPO4（分析纯，北京化工厂）

2 方法

2.1 微透析实验

2.1.1 微透析探针的植入

取250g左右的大鼠，称重后以70mg/kg的剂量腹腔注射戊巴比妥钠，待其昏迷后将其固定在脑立体定位仪上，剃去头部毛发，使用手术刀沿颅骨中锋划开头皮，用止血钳将头皮撑开。用3%的过氧化氢溶液灼烧颅骨上的骨膜，直至清晰露出前囟位置。

以前囟处为原点，在颅骨上找到黑质致密部对应的点（前囱后5.2±0.1mm，矢状缝左侧2.5±0.1mm，颅骨表面下8.5±0.1mm）[4]，用脑钻钻穿颅骨，将微透析探针导管置于黑质致密部，向下深入7.5±0.1mm（减去探针的透析膜长度，本实验中为1mm）。在颅骨的其他部位再钻两个孔，旋入两个小螺丝，使用自凝造牙粉将探针导管与螺丝一起固定住。

2.1.2 微透析操作

待大鼠创口恢复后，使用乙醚轻微麻醉，将微透析探针小心地插入探针导管中，然后将其置于清醒动物活动系统中。待其清醒后即可进行微透析实验。

透析过程：0~2h，使用林格氏液（147 mM NaC1，2.3 mM CaCl2，4mM KC1， pH 6.0），2~5h，使用含有DA的林格氏液。

透析液DA浓度梯度：10μM、100μM、1000μM。此时流速为2μL/min。

透析速度梯度：0.5μL/min、1μL/min、2μL/min。此时DA浓度为1000μM。

2.2 HPLC-ECD检测透析液

使用Discovery®HS F5柱，流动相为0.1M柠檬酸、0.2M Na2HPO4、0.3mM Na2EDTA，6%乙腈，pH 3.75，流速为0.8mL/min，进样量40μL。检测器电势-50、300、350、450mV （主通道350mV）。

2.3 透析效率的计算

3 结果

3.1 不同DA浓度对透析效率的影响

结果如图1所示，透析液中DA浓度越大，透析效率越低。但是从总的透析量上来看，浓度越大能透过的DA量越大。

3.2 不同透析速度对透析效率的影响

结果如图2所示，透析速度越低，透析效率越高。这是因为透析速度降低之后，透析液在微透析探针的半透膜处停留的时间更长，从而更加有利于物质的交换，使DA能够透过更多[5]。

图1 不同多巴胺浓度对透析效率的影响

图2 不同透析速度对透析效率的影响

4 结论

通过本实验，可以看出，微透析过程中的透析效率与透析液中的物质浓度和透析速度有关，浓度越小，速度越低，透析效率越高。但是物质浓度降低之后，能够透过的物质总量也随之减少，透析速度降低之后能够，要灌注一定量的透析液所需的总时间也随之增加，所以要根据实验的要求选择合适的物质浓度与透析速度。

[1]韩慧婉, 舒鸿钧, 刘国诠. 微透析技术及其应用[J]. 化学通报, 2000, 12:52-56

[2]冯飞, 许崇涛. 微透析技术在脑组织研究中的应用[J]. 汕头大学医学院学报, 2008, 21(1):55-57

[3]Giuseppe C, Marina M C, Addolorata S C. Simultaneous measurement of adenosine, dopamine, acetylcholine and 5-hydroxytryptamine in cerebral mice microdialysis samples by LC-ESI-MS/MS[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2012,71:183-186

[4]诸葛启钏译. 大鼠脑立体定位图谱(第3版)[M], 北京:人民卫生出版社,2007.

[5]关里, 赵金垣. 微透析技术在生命科学中的应用[J]. 环境与职业医学, 2008, 25(1):94-96