应用FIAstar5000和透析膜测定牛奶及乳制品中的亚硝酸盐和硝酸盐

董玮洁，许洪宇，辛跃珍

（完达山阳光乳业有限公司，黑龙江 哈尔滨150078）

随着乳品行业的迅速发展，乳品的质量安全也越来越受重视。牛乳中的硝酸盐和亚硝酸盐（以下简称两盐）的含量，也备受关注，而硝酸盐含量的多少还受多种因素的影响，如：季节、天气、菌落总数的多少、饲料等；而硝酸盐在微生物等一定条件下作用，也会还原为亚硝酸盐。亚硝酸盐是一种致癌物质，与人体血液作用，形成高铁血红蛋白，从而使血液失去携氧功能，使人缺氧中毒，轻者头昏、口唇，重者神志不清、抽搐、呼吸急促，抢救不及时可危及生命。不仅如此，亚硝酸盐在人体内达到一定剂量时是致癌、致畸、致突变的物质，可严重危害人体健康。因此，两盐含量的检测至关重要，而原奶数量的增多，国标法检测两盐，根据实际的检验能力，只能进行抽样检测，无法做到全部检测，使得可能含有两盐的样品漏检，导致产品终端含有一定的亚硝酸盐；用FIAstar5000和透析膜技术检测两盐，检测数量多，速度快，大型乳制品企业非常适用此法进行检测。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

FIAstar5000流动注射分析仪（丹麦福斯公司）[1]；漩涡震荡仪(PE-IKAMS3)；电热鼓风干燥箱；蒸馏水或去离子水，或者相当于没有硝酸根离子或亚硝酸根离子的水；磺胺，(4-氨基苯磺酰胺)；N-(1-萘基)-乙二胺二盐酸盐；盐酸，HCL，(ρ=1,19 g/ml)；亚硝酸钠，NaNO2，在110℃～120℃干燥至恒重；硝酸钠，NaNO3，在110℃～120℃干燥至恒重；氯化铵，NH4Cl，氨水；不起泡的实验室洗涤剂，例如：S470。

1.2 试剂的制备

缓冲溶液;用于萃取液，载液和试剂：在1000ml容量瓶中，用800ml水溶解26.6g 氯化铵(NH4Cl)，添加少量氨水(NH4OH)使得pH值达到8.5。稀释至1000ml并混匀。

对氨基苯磺酰胺试剂：在500ml容量瓶中，用250ml蒸馏水溶解5g对氨基苯磺酰胺。添加25ml浓盐酸，小心混合。用蒸馏水稀释定容。

NED试剂：在500ml容量瓶中，用250ml蒸馏水溶解0.5g N-(1-萘基)-乙二胺二盐酸盐(NED)，稀释定容。此试剂应每周重新配制，并保存在黑暗处。

硝酸钠储备溶液：在100ml容量瓶中，溶解137.1mg干燥后的NaNO3，稀释定容成NaNO3浓度为1000mg/L，硝酸钠定标标准溶液。稀释定容时使用缓冲溶液，定标标准溶液应该每日新鲜配制，浓度为0；0.5；1；2；3；5(单位：μg/ml)。

亚硝酸钠储备溶液：在100ml容量瓶中，溶解150.0mg干燥后的NaNO2，稀释定容成NaNO2浓度为1000mg/L。亚硝酸钠过渡储备液：在100ml容量瓶中，移取5.00ml亚硝酸钠储备液，用蒸馏水稀释定容成NaNO2浓度为50 mg/L，亚硝酸钠定标标准溶液。用缓冲溶液稀释定容，定标标准溶液应该每日新鲜配制，浓度为0；0.025；0.050；0.100；0.200；0.400(单位：μg/ml)。

2 前处理方法

2.1 样品的制备

使用一个合适的碾磨设备(4.8)将样品碾碎。将碾碎的物质迅速混合均匀，如果可能，再碾磨一次，然后混合均匀。每碾磨一个样品之后将设备清理干净。如果待测部分不能被碾磨，通过强力的搅拌和揉捏将其混合均匀。碾磨之后马上将样品转入带密封盖的样品容器待测。更好的方法是没有任何耽搁，如果不可避免，做好各种防范措施来确保待测样品保存完好。不要再对碾磨后出现霉变或开始变质的奶酪样品进行分析了。液态奶制品，在50ml离心管中加入5g待测样品，称量准至0.5mg。将萃取缓冲溶液(试剂3.10)预先加热到50℃～55℃，取24ml加入到包含测试样品的离心管。在均质器中搅拌3分钟，被测部分充分分散。在离心机中处理待测试液5分钟(1500g)。将分离后的离心管置于冰水混合物中冷却15分钟。用移液管将离心管中脂肪层下面的脱脂溶液吸出用于流动注射测定。

2.2 样品测定步骤

1. 打开FIAstar分析仪主机及5027采样器电源(如果采用取样器)。

2. 确认安装的测试盒及使用的检测器滤光片是否正确。

3. 开启蠕动泵，将各管路接蒸馏水，检查流路连接是否正常。

4. 打开计算机，启动分析软件，调入方法。

5. 使用SOFIA软件中的Inspect/Read baseline菜单观察水的基线读数，SD(M-R)＜0.1 mAU。

6. 泵入试剂，确认测试盒指示的位置是NO2分析。

7. 当系统充满液体，将测试盒指示的位置转到NO2+NO3分析。

8. 继续泵入试剂直到旁路泵管中的空气全部被排净。

图1 典型亚硝酸盐校正图谱

图2 典型硝酸盐校正图谱

9. 将泵停止工作，取下旁路泵管，并安装上镉柱。

10. 启动泵，让试剂流动直到稳定。

11. 使用SOFIA软件中的Inspect/Read baseline菜单观察试剂的基线读数，SD(M-R)＜0.2 mAU。

12. 将样品放到进样器中，并在SoFIA软件中创建一个样品表。

13. 将定标样品放到进样器中。

14. 将定标系溶液置于进样器，取一标准样品注射几次，检查流路是否平衡并检查系统是否工作正常。通常不同的注射其差别不应超过mAU或ppm读数的2%。

15. 同时检查镉柱的还原效率。16. 制作定标/检查定标。

17. 启动样品表，开始检测。

2.3 检出限

实验检出范围：硝酸盐：浸提液中0.5-5mg/l NO3-,相当于原奶中10-100mg/kg NO3-；

亚硝酸盐：浸提液中0.025-0.4mg/l NO2-,相当于原奶中0.5-8mg/kg NO2-，标准曲线线性相关系数R2 =0.9999。

最低检出限以三倍的标准偏差[2]除以工作曲线的斜率求得硝酸盐检出限为0.552μg/mL；亚硝酸盐检出限为0.0885μg/mL。

2.4 回收率试验

取一组已经测定含量的样品，每个各三份，第一份加入标准液后使它的浓度与样品含量基本相同，第二份加入标准液加入后使总浓度接近线性范围上限，第三份加入标准液后使它的浓度接近（或略大于）检测下限，然后测定算出回收率。

本方法硝酸盐的低浓度回收率为106%，高浓度的回收率为97.8%，与样品相当浓度的回收率为99.8%；亚硝酸盐的低浓度回收率为100%，高浓度的回收率为99.0%，与样品相当浓度的回收率为97.0%.均符合试验要求。结果见表1。

表1 回收率试验结果

3 结论

在样品开始分析前，仪器需要预热15分钟。以下的常规操作过程将自动允许一个合适的预热时间。在启动分析之前，系统需要通过泵入试剂10分钟来平衡。避免在分析或校准期间停泵，因为这将破坏流路平衡。如果必须停泵，再次启动泵后，让系统平衡几分钟。为了弥补运行多个样品时出现的漂移，建议每30分钟进行自动再校准。整个分析时间包括吸入、反应、检测和清洗，一个样品大概50~70秒。从检测器获得的信号进入SoFIA的数据处理系统。通过已知浓度的样品校准曲线，仪器可以计算出样品的浓度。

用此方法检测两盐，检测流程简单、速度快、检测数量多、准确度高、批量检测更节省成本。乳制品企业用此法，可更好的判断分析从原料奶到产成品的质量，将不合格隐患及早发现，以杜绝两盐超标的产品流通。

[1]陈培榕 李景虹 邓勃 . 现代仪器分析实验与技术：清华大学出版社

[2]中华人民共和国国家标准GB5009.33-2011食品中亚硝酸盐和硝酸盐的测定，第三法。