德宏水牛及其杂交后代染色体多态性分析

宋敏艳，高文春，尹正发，杨明超，佴文惠，胡 怡，毛华明，4，史宪伟＊

（1.云南农业大学动物科学技术学院，云南 昆明650201；2.云南省盈江县畜牧兽医局，云南 盈江679300；3.中国科学院昆明动物研究所 遗传资源与进化国家重点实验室，云南 昆明650223；4.云南省反刍动物工程技术研究中心，云南 昆明650201）

德宏水牛主产于云南省西部德宏地区盈江县、瑞丽市、潞西市、陇川县、梁河县和保山、临沧等地区的15个县市，是全国优良地方八大水牛品种之一，素以体型大、体质强健、性情温驯、耐粗饲、适应性强、繁殖力强、产肉性能高而出名［1］。

德宏水牛为役用型水牛，产奶产肉能力较低［2］。自1987年实施“中—欧德宏水牛开发项”以来，为提高德宏水牛的奶肉生产性能，引入印度摩拉水牛与巴基斯坦的尼里·拉菲水牛对德宏水牛进行了大规模的杂交改良［3］。到2009年末，德宏水牛存栏数10.20万头，其中已使用冻精配种1.23万多头次，杂交水牛1.52万多头，能繁母牛3.44万多头［4］。通过与河流型水牛进行杂交，杂交后代产奶与产肉性能显著得到提高。然而，不同类型水牛杂交后代的染色体结构及数目均出现多态类型，研究德宏水牛及杂交后代染色体多态性遗传规律及与生产性能的关系将为德宏水牛进一步杂交改良及品种选育提供科学依据。

家养水牛分为河流型与沼泽型水牛，河流型水牛染色体数为2n＝50，沼泽型水牛染色体数为2n＝48，两者杂交后代可育，并且后代出现染色体多态性［5］。Berardino等［5］利用染色体分带技术研究了河流型水牛与意大利沼泽型水牛染色体特征，黄右军等［6］对广西本地沼泽型水牛与河流型摩拉水牛的核型进行了比较分析，其研究结果均表明：沼泽型水牛染色体数为2n＝48，摩拉水牛为2n＝50，两种类型杂交后代染色体数为2n＝49；沼泽型水牛少了一对河流型摩拉水牛核型中的9号端着丝粒染色体；沼泽型水牛1号染色体为一大的中着丝粒染色体，推测其可能是由河流型水牛4号和9号染色体发生端粒－着丝粒串联融合形成。除此之外，沼泽型水牛与河流型水牛的其余染色体在染色体结构、带型以及着丝粒和核仁组织区都完全一致，这说明河流型水牛与沼泽型水牛染色体具有高度的同源性或一致性。

Harisah等［7］对75头纯种水牛和198头来自菲律宾与马来西亚的杂交水牛进行了染色体分析。结果表明：沼泽型水牛染色体数为2n＝48，河流型水牛染色体数为2n＝50；杂交一代染色体数均为2n＝49；杂交二代产生三种不同的染色体核型：2n＝48，2n＝49，2n＝50；与亲本回交则出现2n＝49和2n＝50两种染色体核型。经卡方检验，杂交二代不同核型的分离比为1∶2∶1，回交后代的核型分离比接近1∶1。黄右军等［8］分析了河流型摩拉和尼里／拉菲水牛（2n＝50）与我国本地水牛（2n＝48）杂交后代的染色体核型，发现三元杂（尼里X摩杂一代／二代）出现2n＝49和2n＝50两种组型，其分离比也接近1∶1。但是，德宏水牛及杂交后代染色体核型特征及多态性遗传规律尚未见报道。

本文对采集的具有不同繁殖性能的20头德宏本地水牛、25头摩拉与德宏二元杂水牛以及35头尼里与摩拉和德宏三元杂水牛进行了染色体核型分析，以期为德宏水牛的品种保护利用及杂交改良提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本实验的水牛样品来自云南省德宏傣族景颇族自治州盈江县旧城、新城和平原3个乡（镇）。共采集了德宏本地水牛20头（♀15头，♂5头），其中6岁以上并配种3次以上均未受孕母牛5头，其余10头母牛繁殖性能良好；摩拉与德宏二元杂交水牛25头（♀21头，♂4头），其中6岁以上并配种3次以上均未受孕的11头，其余10头母牛繁殖性能良好；尼里与摩拉和德宏三元杂交水牛35头（其中：♀31头，♂4头），由于年龄都在2～4岁之间，尚没有繁殖性能的完整记录。在采样时，详细记录水牛的性别、毛色、年龄、外貌特征、父母及后代等特征特性，对于年龄在6岁以上，经过多次配种而未受孕的母牛定义为存在繁殖障碍。对以上繁殖异常水牛进行了外阴与生殖道直肠检查，未发现性器官明显异常。每头水牛均由颈静脉采集血液样品，部分个体采集了耳组织样品。

1.2 样品采集

采血：用碘酒和酒精对牛颈静脉处皮肤进行消毒，用灭菌注射器或采血针采血1～2mL，置于肝素抗凝的采血管中，常温下及时带回实验室。

耳组织取材：用手术刀片将牛耳皮上的毛发及附在其上的脏物刮除干净，用酒精棉球仔细擦拭几遍牛耳取材部位，用灭菌的小剪刀剪取一部分耳缘皮肤，将其迅速放入盛有培养基的小瓶子中常温保存，及时带回实验室。

1.3 细胞培养、G－带染色体及染色体核型分析

参照人外周血淋巴细胞培养法［9］与 Seabright［10］的G－带染色法并略作修改制备中期染色体及G－带染色体标本，对显带和分散较好的分裂相用CytoVision System （Applied Imaging）软件进行图像拍摄和分析。

1.4 统计分析

尼里与摩拉和德宏三元杂水牛染色体分离比例采用χ2检验进行分析。

2 结果与分析

2.1 德宏水牛及杂交后代染色体核型分析

挑选形态清晰、显带和分散良好、收缩适中的染色体中期分裂相，进行显微拍照，并统计染色体数目。结果显示，检测的20头德宏水牛的染色体数目均为2n＝48，染色体臂数为NF＝58，23对常染色体，其中1号染色体是一对大的中部着丝粒染色体，2号染色体为亚端着丝粒染色体，3号为亚中着丝粒染色体，4～5号是中着丝粒染色体，6～23号是端着丝粒染色体，1对性染色体中X染色体是最大的端着丝粒染色体，Y染色体是小型端着色粒染色体（图1～A），与广西本地水牛［11］及德昌水牛［12］的核型一致，符合沼泽型水牛的染色体数目与特征，为德宏水牛属于沼泽型水牛类型提供了细胞遗传学证据。25头摩拉与德宏二元杂水牛染色体数目均为2n＝49，47条常染色体，1对性染色体（图1～B）。35头尼里×（摩拉×德宏）三元杂水牛出现2n＝49与2n＝50两种染色体核型（图1～C，D）。三元杂2n＝49核型特征与二元杂2n＝49水牛一致。而三元杂2n＝50水牛核型中，24对常染色体，1对性染色体，与1994年CSKBB［13］确定的河流型水牛的标准核型一致。

将德宏水牛染色体核型与二元杂和三元杂后代染色体核型进行比较发现：德宏水牛2n＝48核型中少了一对三元杂2n＝50水牛核型中的9号端着丝粒染色体；德宏水牛1号染色体为一对大的中着丝粒染色体（图1～A红圈标注），2n＝50水牛1号染色体为一对亚中着丝粒染色体；德宏水牛1号染色体的G－带与2n＝50水牛4号和9号染色体相吻合（图1～D红圈标注），染色体长度近同，因此推测沼泽型水牛1号染色体可能是由河流型水牛4号和9号染色体发生端粒－着丝粒串联融合形成的，这与Berardino等［5］报道的结果一致；2n＝49核型中的9号染色体不配对，4号染色体为两条形态不同的染色体，一条为巨大4／9易位中着丝粒染色体，另一条为较小的原9号端着丝粒染色体（图1～B，C红圈标注）。

2.2 水牛染色体核型与繁殖性能的关系

对采集的20头德宏水牛和25头摩拉与德宏二元杂水牛的繁殖记录与染色体核型进行分析，德宏水牛染色体数均为2n＝48，摩拉与德宏二元杂水牛均为2n＝49。虽然我们采集的德宏水牛和摩拉与德宏二元杂水牛均包括了配种及产仔数异常的母牛，但没有检测到染色体畸变现象，在有记录的繁殖障碍与繁殖性能优良的个体间也没有检测出染色体差异。而采集的35头尼里×（摩拉×德宏）三元杂水牛年龄都在2～4岁之间，尚没有繁殖性能的完整记录，因此三元杂染色体多态性与繁殖性能的关系有待进一步研究。

图1 德宏水牛及杂交后代染色体核型

2.3 德宏水牛及杂交后代染色体多态性遗传规律分析

德宏水牛染色体数为2n＝48，属沼泽型水牛，其与河流型摩拉水牛杂交，杂交一代染色体数为2n＝49。随着杂交代数的增加，杂交二代（三元杂）出现两种染色体核型，分别为2n＝49，2n＝50；其中2n＝49核型占20头，2n＝50类型占15头，经卡方检测，χ2＝0.45714，χ2＜，P＞0.05，因此2n＝49和2n＝50两种类型的核型分离比符合1∶1的关系。值得一提的是，无论2n＝49或2n＝50都呈现染色体平衡遗传，即两种类型染色体的DNA总量没有出现明显的重复和丢失，基因的总量基本相等。对摩拉与德宏水牛二元杂水牛2n＝49核型进行分析，该核型中有3条不能配对的常染色体。黄右军等［8］、梁梦玫等［14］、马彩霞等［15］对其减数分裂联会复合体及其精子染色体进行研究与分析发现，正是由于这3条不配对的常染色体，在减数分裂粗线期形成一条三价体联会复合体，后期Ⅰ分离时，进行平衡分离产生两种正常配子，n＝24和n＝25，两种配子的染色体数目虽然不同，但遗传物质总量是平衡一致的。当2n＝49水牛与2n＝50河流型尼里水牛杂交时，导致其子代出现染色体多态性：2n＝50，2n＝49。进行不平衡分离产生两种异常配子，n＝24＋1和n＝25－1，异常配子与正常配子结合时，则导致非整倍性变异，同源染色体配对出现异常而致胚胎不能存活。本实验检测的35头尼里×（摩拉×德宏）三元杂水牛染色体均由正常配子结合，未出现异常配子结合类型。

3 结论与讨论

家养水牛分为河流型与沼泽型水牛，河流型水牛染色体数为2n＝50，沼泽型水牛染色体数为2n＝48。与马和驴、黄牛与牦牛及鸡与鹌鹑等不同染色体数目的物种之间杂交后代不育或单性不育不同，河流型与沼泽型水牛杂交后代双性均可育，并且出现染色体多态类型［5，7］。仔细查看河流型与沼泽型水牛染色核型及染色体多态性特征，可发现它们的染色体差异涉及两对非同源染色体，即河流型水牛4号和9号染色体易位形成沼泽型水牛1号染色体。染色体易位包括单向易位、罗伯逊易位及串联易位，从图1可看出，沼泽型水牛1号染色体是由河流型水牛4号和9号染色体串联易位而成，并且是由9号端着丝粒染色体与4号亚中着丝粒染色体的短臂（p臂）发生串联融合。与其他易位类型不同，串联易位形成的新染色体与原染色体在染色体长度、DNA含量之间差异较小，这可能就是河流型与沼泽型水牛杂交后代可育并出现染色体多态性的主要原因。具体这种串联易位的起源与进化机制以及串联融合所带来的遗传效应与表型效应尚待进一步研究。

虽然我们在样品采集与染色体分析过程中，有意识的选择了有明显繁殖障碍的德宏水牛及摩拉与德宏杂交水牛，期望找到与繁殖障碍有关的染色体变异，然而德宏水牛及二元杂后代不同繁殖性能个体间无论在染色体核型、G带带型还是染色体数目方面均无显著差异。黄右军等［6］比较了三元杂水牛2n＝49与2n＝50出产月龄、妊娠期、产后第一次发情、产仔间隔、情期受胎率及年受胎率等繁殖性能，发现2n＝49个体比2n＝50个体情期配种受胎率降低12.3%，年受胎率降低6.4%。由于本实验采集的35头尼里×（摩拉×德宏）三元杂水牛年龄都在2～4岁之间，尚没有繁殖性能的完整记录，因此德宏水牛三元杂后代染色体多态性与繁殖性能的关系有待进一步研究。

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