血管内皮生长因子逆转录病毒表达载体的构建

王 进,师 杨

(周口师范学院生命科学系,河南周口466001)

血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)为一类糖蛋白,在血管形成中是一个基本调节因子。它具有增加血管渗透性、诱导血管发生、促进细胞生长和迁移、抑制细胞凋亡等作用。近来,在神经再生的研究领域发现, VEGF除具有促进缺血脑血管发生外,尚有直接的神经保护和促进神经发生作用[1]。人们希望能将其应用于中枢神经系统疾病的治疗,但由于它是生物大分子,常规静脉注射或反复脑内注射都不能很好地发挥作用,用基因治疗的方法解决上述给药途径的问题将会是很有希望的方案。尝试构建VEGF基因的逆转录病毒表达载体,以期为VEGF基因修饰的靶细胞脑内移植治疗中枢神经系统疾病的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 生物材料

pcDNA 3.1-VEGF含有人血管内皮生长因子(VEGF165)的cDNA,由周口师范学院生命科学系分子生物学实验室构建保存。逆转录病毒载体pLXSN购自Clontech公司。pA317细胞和NIH3T3细胞购自中国科学院上海细胞生物学研究所。

1.1.2 主要试剂

限制性内切酶、T4DNA连接酶、Polybrene和G418购自promega公司;质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、DNA提取试剂盒购自上海华舜生物公司;Lipofectanine转染试剂购自invitrogen公司; DEME/F12培养基购自Hyclone公司。

1.2 试验方法

1.2.1 pcDNA3.1-VEGF的双酶切及目的基因片段胶回收

pcDNA3.1-VEGF质粒在大肠杆菌中扩增后测序鉴定,无碱基突变及序列缺失。根据酶切位点选择EcoRⅠ和XhoⅠ两种酶双酶切质粒pcDNA3.1-VEGF和质粒pLXSN,然后进行琼脂糖电泳,用胶回收试剂盒回收570bp目的基因片段。

1.2.2 pLXSN双酶切

根据pLXSN的多克隆位点,选择EcoRⅠ和XhoⅠ两种酶双酶切。琼脂糖电泳后,用胶回收试剂盒回收6kbp片段。

1.2.3 pcDNA3.1-VEGF重组体的构建

将胶回收获得的VEGF与pLXSN片段按3∶1的比例用T4DNA连接酶连接反应过夜,产物转化感受态JM109菌。次日从平板上挑6个单菌落,分别摇菌,提取质粒,双酶切鉴定。扩增JM109菌液5mL进行基因测序,并与公布的VEGF165基因序列进行校对。

1.2.4 病毒的包装

将pA317包装细胞接种于培养皿,置37℃、5%CO2培养箱培养18～24h。待细胞贴壁生长达75%融合时,弃去细胞培养液,用无血清培养基洗涤细胞1次,然后以Lipofectamin介导质粒DNA转染:2μg质粒及10μL脂质体分别用无血清、无双抗DEME培养液稀释至100μL。轻轻混匀,室温静置45min后,加入DEME/F12,平铺到pA317细胞上,置于37℃、5%CO2培养箱培养15h后,加入含20%FBS的DEME,次日更换普通培养液培养48h,然后用0.8g/L G418培养液筛选3周。

1.2.5 病毒滴度测定

将NIH3T3细胞置于6孔板中,每孔中细胞为0.5～1X105个,每孔加入2mL无血清培养基。将细胞培养上清液(病毒液)用含Polybrene的完全培养基倍比稀释,即每稀释一次浓度减小10倍。每孔NIH3T3细胞中分别加入1mL稀释后的病毒液,Polybrene的终浓度为4mg/L。感染一周后,加入选择培养基,直至可见细胞克隆,倒置显微镜下计算克隆形成数,病毒滴度用含有细胞克隆的稀释度最高的病毒液浓度表示。

2 结果与分析

2.1 酶切与测序分析

用EcoRⅠ和XhoⅠ两种酶双酶切pcDNA3.1-VEGF,电泳后在6kbp和570bp出现两条亮带,与理论值相符。双酶切pLXSN后,电泳只显示6kbp条带。测序结果经比对,不存在碱基插入突变,与公布序列一致。

图1 pLXSN-VEGF重组体酶切结果

2.2 病毒滴度测定

用pA317-VEGF病毒上清感染NIH3T3细胞,在G418选择培养基中,约3周可见抗性细胞克隆形成,平均病毒滴度为6.5X105cfu/mL,最高为1.8X106cfu/mL。

3 讨论

脑梗死后有许多细胞因子可以促进局部血管的形成,增加局部血供,在脑梗死后1～3h内, VEGF的浓度增加,并明显促进血管生成[2]。 VEGF能刺激轴突生长和改善神经细胞的存活,在病理状态下VEGF对中枢神经系统有保护作用。脑梗死后,在脑梗死灶及周围给予VEGF可以有效增加缺血半暗带的血供[3,4]。研究证实,应用外源性VEGF可促进新生血管的形成,减少脑梗死面积,并能刺激轴突生长和改善神经细胞的存活,对神经细胞具有直接保护作用[5]。但是VEGF注射到局部后很快降解,作用难以持久,治疗效果有限。若能借助基因治疗的手段,将VEGF基因转染到移植细胞内,移植细胞将作为基因转移的载体,把治疗基因携带进入缺血半暗带表达VEGF,从细胞移植治疗和基因治疗两方面干预脑缺血,预期会有更好的治疗效果。

逆转录病毒载体的优点是可将目的基因整合到靶细胞染色体中,具有细胞感染率高,导入的基因拷贝数多,外源基因表达长期稳定的特点,是目前最为成熟的基因治疗载体之一。而质粒的转染效率低,且要长期稳定表达需要大量筛选工作。腺病毒载体虽可高效转染靶细胞,却不能将目的基因整合到染色体中长期、稳定表达,故不适合需长期表达的转基因治疗。pLXSN逆转录病毒载体较之传统的病毒表达系统,构建和筛选更加简单,它的5'LTR序列包含增强子能够控制多克隆位点中目的基因的表达。SV40启动子控制新霉素抗性基因的表达,用于真核细胞中的抗性筛选,经G418处理后,稳定感染的基因修饰细胞仍能存活,而未被感染的细胞则被杀死。根据包装细胞的不同,pLXSN可以瞬时表达和长期稳定表达,本研究采用的pA317包装细胞可使其携带基因长期稳定表达。

本试验把双酶切目的基因与pLXSN连接,进行包装后感染细胞,从而构建成含有VEGF基因的真核表达载体。结果显示,重组载体经pA317细胞包装后,达到一定的病毒滴度。酶切结果及测序表明,连接方向正确,无插入缺失突变。说明成功构建了VEGF基因的逆转录病毒表达载体,为后续转染移植细胞进行基因治疗奠定了基础。

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