MiRNA及其与肺癌早期诊断的新认识

曾凤枝

肺癌是导致全球癌症死亡的最主要原因，每年因肺癌死亡的人数超过100万，且每年新增病例120万。肺腺癌是最常见的癌症，其中，约80%的肺癌是非小细胞肺癌（non small cell lung cancer，Nsclc），尽管手术、放疗、化疗技术不断提高，但Nsclc的总体生存率仍小于20%[1]。被认为是目前对人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤 。微小RNA（micro RNA，MiRNA）是一类分子量为22个核苷酸左右的内源性非编码RNA，于1993年被首次认识，是细胞发育、凋亡和代谢等多种维持生命必需的生物学功能调节因子，MiRNA调节人类近30%的基因表达[2]。在基因组上，约有超过50%的MiRNA定位于与肿瘤相关的脆性位点（fragile site）[3]。Small等[4]研究表明，MiRNA已成为许多重要生物过程的主要调节因子，在肿瘤和心血管疾病发生发展中发挥了重要作用。现就MiRNA的分子生物学研究及其与肺癌早期诊断关系的新认识综述如下。

1 MiRNA概述

继1993年在果蝇中发现第一个MiRNA以来，现已有15172个MiRNA相继在脊椎动物、蠕虫、果蝇、植物和病毒等142个物种被发现，通过克隆技术（Cloning technology）、深度测序（deep Sequencing）以及复杂的生物信息学和遗传筛选等方法，发现并鉴定在人类基因组中可能存在的1000个MiRNA[5]，参与生命过程中一系列重要进程，包括发育、增殖、分化和凋亡等。

1.1 MiRNA的分子生物学特征 （1）MiRNA的长度为18~22 nt，在3’端可以有1~2个碱基的长度变化。（2）MiRNA为单链结构，其5’端有一个磷酸基团，3’端为羟基，该结构特点是使其与功能RNA的降解片段和大多数寡核苷酸保持区别。（3）MiRNA具有较强的同源性，来自不同基因簇的MiRNA的同源性较弱，其表达具有组织特异性和时间特异性。（4）MiRNA广泛存在于真核生物基因组中，其本身不具有开放阅读框架，是一组非编码蛋白质的短序RNA[6]。

1.2 MiRNA的生成及作用机制 MiRNA的生成过程包括转录、加工成熟及功能复合体装配几个主要步骤。研究表明，MiRNA的生成和作用须要经历两个阶段：（1）MiRNA基因经RNA聚合酶Ⅱ的作用转录生成初级MiRNA（pri-MiRNA），再由RNA聚合酶Ⅲ-Dorsha-DGCR8复合体进行切割形成前体MiRNA（pre-MiRNA），在细胞内完成[7]。（2）在核酸酶Dicer（属于RNaseⅢ家族）、RNA聚合酶Ⅲ及旋解酶的共同作用下将其剪切为21~23个核苷酸长度的双链MiRNA，最后，双链MiRNA被降解，其中5’端相对不稳定的一条链被结合到核蛋白复合体并参与形成RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）[8]，而另一条链随即被降解，进入RISC的MiRNA直接与Argonaute（AGO）家族的蛋白质结合，作为“向导”分子介导RISC剪切靶基因mRNA使其降解，或结合到靶基因mRNA的3’UTR抑制靶基因mRNA翻译，从而在多种生物学过程中发挥功能[6]。

2 MiRNA在肿瘤发生发展中的作用

MiRNA在转录后水平调控基因的表达。超过半数的MiRNA定位于与肿瘤相关的脆性位点[3]。近期，Zimmerman等[9]研究认为MiRNA通过调控靶基因的表达进而参与一系列生理和病理进程包括调节细胞自我更新、凋亡、干细胞分化和肿瘤的发生及转移等。不同类型肿瘤有不同组合的异常MiRNA表达谱。MiRNA可通过类似癌基因和抑癌基因的作用参与肿瘤发生、发展和转归过程[10]：（1）具有癌基因作用的MiRNA，通常处于静止或低表达状态，其活化可导致细胞癌变。在肿瘤组织中，某些MiRNA表达水平明显上调，表现出癌基因的特征。（2）具有抑癌基因作用的MiRNA：具有抑制细胞过度生长和繁殖，遏制肿瘤形成，其失活亦可导致肿瘤的发生。Ueda等[11]在所诊断的胃癌病例中，22个MiRNA升高，13个降低，292例样本均可由MiRNA差异表达，精确区分。其主要方式为抑制翻译或降解mRNA。

3 MIRNA在肺癌中的调控机制和主要表达谱

肺癌中MiRNA的调控机制大致可分为三类[12]：（1）转录后调控。（2）表观遗传学（epigenetics）调控。（3）MiRNA自身的表达调控，即MiRNA的单核苷酸多态性（single nucleotide ploy morphison，SNP）。MiRNA的多态性与肺癌形成密切相关。表1表明与肺癌相关的主要MiRNA表达谱及其靶基因和作用机理。

表1 肺癌相关的主要MiRNA表达谱、靶基因及作用机理

4 MiRNA与肺癌早期诊断的关系

目前，对肺癌的早期诊断存在困难，其被发现时2/3已为晚期。因此，如何提高肺癌早期诊断率已成为改善患者预后的重要课题。作为一种非侵入性诊断方法，MiRNA的出现和应用为早期诊断肺癌提供了准确可靠的支持。Chen等[13]通过深度测序分别检测非肺癌患者与肺癌患者血清，发现其中有8种MiRNA在上述两种人群血清中存在表达差异。Lodes等[14]通过交叉验证分析预测肺癌的存在具有很高的准确性，并表明血清中MiRNA的分布有助于肺癌的早期诊断。Rabinowits等[15]发现肺癌组MiRNA表达显著高于对照组。Reller等[16]分别检测Nsclc组和对照组细胞中17个和19个MiRNA，发现有27个MiRNA在肺癌组显著下调，分析后结果表明，MiRNA诊断肺癌的准确率为95.4%，特异性为98.1%，敏感度92.5%。近期，Mascaux等[17]研究认为，支气管肺癌发生的整个过程均伴随着MiRNA表达谱的改变，而且，在支气管肺癌形成的早期阶段，MiRNA就已参与其中，因此，MiRNA很可能成为肺癌早期检测的手段。业已证明，血清中MiRNA的表达水平与血浆中的表达水平基本没有区别 。晚近，Wittmann等[18]认为，血清MiRNA作为癌症早期诊断工具具有下列优势：（1）MiRNA在癌症患者血清中表达异常，且具有高稳定性。（2）MiRNA表达具有组织特异性。（3）获取方式为非侵入性，简单易行。

肺癌患者痰液也是值得留取和检测的有价值的标本。Xing等[19]对6个MiRNA进行pt-PCR检测，结果表明联合3个MiRNA：miR-205、miR-210、miR-708用以诊断肺鳞癌的敏感度和特异度分别为76%和96%。联合4个MiRNA：miR-21、miR-486、miR-375、miR-200b，在诊断肺腺癌时的敏感度和特异度分别是80.6%和91.7%[20]。

5 小结与展望

MiRNA是近几年生命科学的一大研究热点，与人类疾病之间有密切关系。目前，人们对MiRNA的生物学特征、生成及作用机制，以及其在肺癌中的异常表达等，已有较全面的了解，这有助于为肺癌的诊断、治疗提供新的途径，为今后肿瘤的预防和早诊早治提供有力的理论和实践依据。癌症患者的MiRNA检测同时结合病理学检查，有助于提高疾病诊断的准确性。未来，MiRNA将作为血清学标志物显示其诱人的应用前景，随着MiRNA的研究进展，肺癌患者将会显著获益。

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