新城疫病毒在全球的变异研究

黎先伟译

自从1926年发现新城疫病毒以来，已经鉴定出Ⅰ型病毒有9个基因型和Ⅱ型病毒有10个基因型，代表着一种形式多样且不断演变的病毒。从全球的家畜流行病中一种强毒的基因型的出现及观察新城疫强弱毒的基因组序列年与年之间的变化暗示着新城疫病毒不同的基因型在全球不同的地理位置同时演变着。这巨大的基因组多样性可能会使更多的各种各样的鸟类易于受到新城疫病毒的感染以及以经常迁徙的野鸟为储藏所。新城疫病毒基因组的多样性增加了诊断失败的可能性，结果导致不明感染。不断地进行流行病学监测以及积极主动地鉴定流行株以确保免疫和PCR试剂能有效地鉴别世界范围内新城疫病毒的流行株。一种新型基质聚合酶复合试验能够检测目前全球大多数新城疫病毒的流行株。通过改进的融合蛋白技术目前已经用于鉴定美国和欧洲强毒力的鸽新城疫病毒流行株。在新分离的毒株中含有未知的基因序列，让目前成熟的随机引物测序的方法应用整合到诊断方法上来。此外，对于目前新城疫病毒的分型方法是不适当的。在本文中，我们回顾有关新城疫病毒进化的分子流行病学和目前诊断出现的问题。同时，解释说明为什么需要在客观的标准下建立一个新的分型方法。

一、新城疫（ND）

新城疫是由新城疫病毒感染引起的，可能能感染大多数种类的鸟类，对于易感的家禽具有高度的感染性和致死性。新城疫是最重要的家禽传染病之一，因为该病广泛存在与全世界，而且有可能造成巨大的经济损失。该病至少发生于亚洲、非洲、美洲等六大洲，在许多国家也是地方性动物病。在美国，新城疫强毒株被归类为特殊的病原体，这些毒株在家禽中并不普遍，有这些毒株引起的疾病通常被称为外来的新城疫（END）（USDA,2006）。在世界各地，由新城疫强毒株暴发的新城疫一直威胁着养禽业。在2008年临床确诊暴发新城疫的国家有多米尼加共和国、伯利兹城、秘鲁、芬兰和日本。或许一些暴发新城疫却没有报道的国家遍及非洲。在亚洲新城疫强毒株也很普遍。

在鸡新城疫的不同菌株中，临床表现有明显的差异。强毒株的感染有3种明确的临床分型：（1）嗜内脏速发型新城疫，以急性致死性败血性感染，病死鸡有明显的消化道出血性病变；（2）嗜神经速发型新城疫，呈急性致死性感染，以呼吸道和神经症状为特征，但通常很少发生内脏病变；（3）中发型新城疫，引起呼吸道和神经症状症状，但致死性较低。在一些家禽新城疫强毒株普遍存在的国家需要加强疾病监测和管制，以免对商业生产和家禽及其产品的国际贸易带来严重影响。低毒力的新城疫病毒通常被认为是弱毒的，而且普遍存在于美国。另外，弱毒力的毒株被分型为缓发型新城疫，一般只引起轻度的呼吸道症状。弱毒株也可以被归类为无症状肠型，主要引起肠道感染，无呼吸道症状。

二、新城疫病毒（NDV）

新城疫病毒作为禽副黏病毒I型是副粘病毒科禽腮腺炎病毒属的成员。它是单股负链不分节段的有囊膜的RNA病毒。新城疫病毒基因组包括六个基因，分别编码六个结构蛋白：NP蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、HN蛋白和L蛋白。在P基因的转录过程中会出现mRNA的编辑现象，因而可能会产生额外的蛋白质，如V蛋白及W蛋白。虽然新城疫病毒毒力是多基因相关的，但是F蛋白的裂解位点却是毒力改变的主要因素。

三、新城疫病毒分类

不同基因型的禽I型副粘病毒在世界各地流行。尽管所有的新城疫病毒都属于禽副粘病毒I型，但是也存在抗原和遗传多样性。目前对于新城疫病毒主要有两种分类方法。一种分类方法是有Aldous组提出的将新城疫病毒分为6个谱系以及13个亚谱系，后来还增加了额外的三个亚谱。另一种分类方法是将新城疫病毒分成两系即I系和II系，其中I系可以分为9个基因型，II系分为10个基因型。因为这两种系统分类方法都是基于类似的基因组信息，所以他们之间的差异只是名义上的。1B图中显示的是II类病毒，显示了两个系统分类方法之间最显著的差异。例如，基因III型，IV型，V型和VIII型组成了Aldous系统中的谱系3.两种系统同时命名存在的问题在表1中说明，表1中已经列出不同基因型间的平均进化关系分歧。大部分基因型间的进化距离在0.041到0.181之间。但是在基因VI型中，VIc 和VIf之间的进化距离在0.061而基因III型和IV型之间的进化距离在0.041，说明基因VI型可能需要进一步分类。进化分析表明不同基因型之间的进化距离存在一个较大的变化。例如，在基因IX型中的进化距离是0.004而在基因III型中则是0.085。区分基因型在距离上的巨大差别以及其他标准的匮乏都表明现在需要一个科学会议去讨论和建立一个客观的标准以期得到广泛的认可和一致的分类。

在本文中，我们将用第二种分类方法。禽副粘病毒I型基因组至少有三种长度，15186，15192和15198个核苷酸。I系病毒是来源于鸡和形目鸟类的弱毒株。I系病毒的基因组最长为15198个核苷酸。这些病毒至少包括9个基因型。这些病毒可能分布在世界各地的野生鸟类，并且经常在活禽市场的样本中分离到。

II系病毒研究的比较详细，包括10个基因型。基因型包括早期的I, II, III, IV 和IX型，含有15186个核苷酸。后来出现的病毒V, VI,VII, VIII, and X型含有15192个核苷酸。除1998至2000导致澳大利亚新城疫暴发的病毒以外，其他II系病毒中的基因I型毒株都是弱毒株，其中很多经常被用来做弱毒疫苗。II类病毒中的基因II型病毒包括很多在世界范围被用作疫苗候选株的弱毒株，如LaSota，B1和VG/GA株。它还包括一个强毒株TXGB，这个毒株在美国相当于一个标准强毒株，被用来评价新城疫疫苗的有效性。20世纪四五十年代，在美国上述提到的疫苗都可以很有效的抵抗强毒株如TX/GB株和堪萨斯州的曼哈顿株的攻击，然而基因II型的强毒株在美国已不再流行。基因III型毒株大多是1960年前在日本分离的，但也有1969年和1985年在台湾分离的以及1990年在津巴布韦分离的。基因IV型病毒是1970年前的欧洲主要的分离株。

基因V, VI, VII, 和VIII型病毒是全球范围流行的主要的基因型，并且只有强毒株。基因V型病毒于1970年出现在南美和中美，导致了同年欧洲新城疫的暴发。这些病毒也造成了在北美佛罗里达州（1971年，1993年）和加利福尼亚州（1971年，2002年）新城疫的暴发，而且依然在墨西哥流行。基因VI型病毒出现在20世纪60年代，在亚洲直到1985年基因VII型病毒逐渐普及之前它都是主要的病毒基因型。基因VI型病毒可以进一步分为Via到VIg，其中VIb大部分分离自鸽。

表1 评估不同基因型间的平均进化分歧

图1 新城疫病毒系统进化树 （a）为I类病毒（n=216）；（b）为II类病毒（n=956）

基因VII型最初分为两个亚基因型，VIIa和VIIb。VIIa的代表病毒主要在90年代出现在远东，后来蔓延至欧洲和亚洲。VIIb的代表病毒出现在远东并且蔓延至南非。这两个基因亚型又可以进一步分为以中国，哈萨克斯坦，南非分离株为代表的VIIc，VIId，VIIe以及以非洲分离株为代表的VIIf，VIIg和VIIh。VIII型病毒在20世纪60年代流行于南非，并且在东南亚持续流行。基因IX型病毒是一个特殊的群体，它包括1948年从中国分离的第一个强毒株，而且在中国时有分离。基因X型病毒在1969年和1981年全部分离自台湾。除了基因IV型以外（1989年以后再未报道过），大部分基因型现在仍在流行。

四、低致病性新城疫病毒的进化

关于低致病性NDV的进化鲜为人知，因为大部分的报道都是关于强毒株的研究。在全球范围内来看，Ⅰ系的所有基因亚型和Ⅱ系的基因Ⅰ型和基因Ⅱ型的低致病性新城疫病毒通常是在家禽和野鸟体内分离得到。在美国，家鸭中的强毒株不是地方流行的，接种疫苗主要是为了保护由本土所流行的低致病性新城疫病毒引起的呼吸道疾病带来的经济损失。此外，假如禽群没有一致接种活新城疫疫苗或者另一种疫苗干扰新城疫疫苗的作用，那么那些疫苗保护不佳的禽只几天后就会发呼吸道疾病。疫苗的反作用被称作“滚动效应”。病毒在禽只间传播时，呼吸道疾病的传播可能是接种疫苗失败后的传播比接种疫苗初更为严重。虽然在滚动效应中的相关病毒被假设是最初的疫苗，与这些毒株的基因特性无关，但是包含来自野鸟的低致病性新城疫病毒的可能性不能被忽视。

野禽感染的大量的不同型的无毒力病毒，这些病毒通常不会引起家禽的临床症状。近来对分离自美国野禽和LBM的无毒力NDV进行系统发生分析发现大约70%的毒株属于I系，30%的毒株属于II系。几乎一半的I系毒株来自驯服野鸭。在这个单一物种，代表了I系基因型的九分之六，这表明某些物种极易受到感染新城疫病毒，并可能成为储存器。野禽是II系病毒的携带者但没有致命的病毒存在。这些II系病毒分为基因I型和俩个新的亚型：IIa亚型和Ia亚型。Ia亚型病毒是与澳大利亚流行株相关毒株，包括来自澳大利亚1998年新城疫大暴发的强毒株。IIa亚型赌注是以前分离自阿根廷和西班牙的毒株。没有野禽的病毒是通常用的疫苗株，B1和LaSota株。考虑到每年在美国和世界各地应用活病毒的家禽数量是令人惊讶的。如以前描述的通过比较单克隆抗体在不同的LaSota株之间的粘合模式来观察II系病毒不同强毒株的抗体水平。例如，当一个小组的九种单克隆抗体对抗来自美国1986至1999年从野鸭分离出的58种病毒的测试，揭示七个不同的结合模式。考虑这项研究，只研究来自雁形目和!形目，新城疫病毒已经被纪录的感染至少241种不同禽类，存在不同单克隆抗体结合模式在其他禽类似乎是合理的。广大的新城疫病毒系统发育多样性显示在这有限的野生鸟类种群中，产生更多基因型的潜力没有被发现。

一般而言，1系病毒属于野禽病毒。在美国和亚洲发现的很多种类的新城疫病毒，在野生鸟类中相关病毒基因的存在表明，流行病存在这些种群之间。美国从1986到2005年收集的菌株发现 LBM 菌株和WS菌株之间有密切的亲缘关系。

香港在 2003到2005年之间，从LBM家禽中分离出了Ⅱ类病毒。这表明这些病毒在LBM鸟类和野生鸟类世界中传播。2003年分离自安大略12周龄的家养火鸡的2系1a基因亚型病毒经鉴定与2001年分离自美国新泽西海鸟毒株的亲缘关系最近，可能表明这些病毒种群在野鸟和家禽间传播。

2系1a亚型和1系病毒已经在美国的LBM鸡中分离到。分离自野禽的新城疫病毒被预言是低致病性病毒，在家禽中存在与低致病性到高致病性基因变异的可能。至少1系中的一株强毒株的病原学鉴定曾引发疫情大暴发。那些已在野禽和LBM被发现的相似亚型的强毒株已经复原。1990年爱尔兰暴发的疫情是由1系强毒株引起，1998-2000年澳大利亚暴发的疫情是由2系Ia亚型强毒株引起。正是理论上的弱毒株在爱尔兰水禽中的循环突变为强毒株并形成了引起1系强毒的准毒株。对来自澳大利亚疫情暴发时别的2系Ia亚型病毒进行基因组分析，也可提供弱毒株已经拥有随着时间变为强毒株的潜力，也证明了是在天然病毒的融合蛋白的切割位点发生了改变导致毒力增强。

有些地方性弱毒病毒只要两个位点发生变异就可形成强毒。除野外条件下，有些弱毒NDV在实验条件下具有形成强毒株的能力。这些因素可能会增加疾病暴发的危险，对疾病的预测，需要研究进化对NDV的基因组所产生的影响。

（1）融合基因中极少部分的核酸发生改变就足以促使DNV由弱毒变为强度。

（2）在自然界中，家禽可能容易接触到含有弱毒病毒的大型流动水库。

五、新城疫病毒强毒株和新城疫疫苗在进化过程中的作用

虽然新城疫病毒强毒株最有可能的储存库在已接种过疫苗的家禽中，但有证据表明野鸟可能是中发型病毒的自然储存库。新城疫病毒强毒株属于基因Ⅴ型从1975年到2008年已经在一种双脊突的鸬鹚上分离到，而他们涉嫌与较早之前暴发的新城疫有关。1981年第一次从鸽子体内分离到鸽副粘病毒Ⅴ型强毒株在鸡上临床表现为嗜神经性，而且继续在世界范围内鸽属动物内传播。虽然在较早已有记录，鸽子内分离到的是嗜内脏型的新城疫病毒强毒株，典型的鸽子分离株在引起嗜神经性基因Ⅵb型的位点发生变异，拥有特异的单克隆抗体结合模式，而且经常不能使鸡红细胞凝集。其他强毒株偶然会从进口的热带鸟类体内分离到，但在经确认在其他物种的尸体中也有病毒库的存在。事实上，经研究表明一些野鸟并不是天然的新城疫强毒株，而是出口以前在检验站感染而来。

从鸬鹚和鸽子体内分离到新城疫强毒株被认为是中发型新城疫，因为它们在鸡体内的ICPI变化范围在0.7至1.5之间，而且在家禽内通常不会引起显著的疾病。然而，在最近美国指出ICPI指数大于0.7或氨基酸序列与新城疫强毒株相一致就认为是强毒株，并把它们归类为极好的因子，以遵循OIE和EU的标准。虽然鸬鹚和鸽子的病毒不断进化和表现基因型也在不断改变，但从野鸟获得的样品中新城疫病毒的毒力并没有发生显著的变化。

1系弱毒株和2系中发型新城疫以及鸬鹚和鸽子中的基因Ⅴ或Ⅵ所独有的优势与目前流行于接种过疫苗的家禽内嗜神经性新城疫病毒（Ⅱ类，基因Ⅴ-Ⅹ）相比，暗示着疫苗的免疫作用可能对多种形式的新城疫强毒株进行选择。尽管加强疫苗的作用，家禽中新城疫强毒株不确定的存留在亚洲、非洲和美国中部的一些国家也会有周期复发的现象。目前家禽生产系统的结合特征可能包括：（1）宿主基因同质性，（2）高密度的饲养（增加了动物之间的接触，有利于高致病性的毒株传播并覆盖弱毒株）；（3）过强的免疫程序提供了病毒在免疫压力下的选择作用和在一些发展中国家试验不合理的免疫程序，都有可能使强毒株不断的进化。然而，良好的监测研究并没有切实开展，用以证明免疫接种在新城疫病毒强毒株进化过程中所起到的作用。

系统进化树和抗原的荧光分析在疫苗和目前流行的强毒株之间可能可以促进新城疫病毒强毒株的进化。许多研究已经证明目前使用的疫苗可以预防疾病，但并不能阻止病毒的脱落。另外有研究表明，使用基因重组疫苗可以显著地减少病毒脱落的出现。

目前已经发现可以逃避免疫接种的变异毒株。在韩国不同地点和时间点分离到的变异新城疫病毒株的频率从2002年的21%增加到2003年至2006年的85.7%。不幸的是，所分析的病毒株的总量较少（56个样品），而使流行病学特性并不确定。这些作者进一步鉴定HN基因上一个变异表位，发展了以LaSota病毒株为骨架利用变异的HN基因病毒株的重组疫苗。使用含有相匹配的灭活的疫苗毒株并指出与商业疫苗在对抗致病率和死亡率方面有相同的保护作用。而且，这类重组疫苗在预防产蛋鸡疾病方面有更佳的效果。可惜的是，在本次研究中并没有对病毒的脱落进行评价。

基因变异也可能出现在墨西哥。新城疫病毒在墨西哥第一次被分离到的时间是在1946年。在最近一次报道的由于新城疫强毒株引起的大暴发是在2000年，当时屠杀了1.36×107只野鸟和对93个养殖场进行了隔离（OIE，2003）。这次新城疫大暴发以后，对受影响的区域加强免疫接种的程序。对墨西哥病毒的融合基因全基因编码区域与已经公布的其他已知的Ⅱ类新城疫病毒基因型进行系统进化的比较，结果表明1998年到2006年从墨西哥分离到的病毒株归类为Ⅱ类基因Ⅴ型病毒（Perozo et al.,2008）。然而，分析本次研究病毒分离的清晰地系统进化分为早期（1998-2001年）和近期（2004-2006年）两组，遵循ICPI和MDT的结果。这次结果显示1998年至2001年期间存在着一些明显的选择压力导致病毒出现新的组别。1998-2001年的分离株与1996-2001年墨西哥报道的其他病毒具有高度的一致性，达到98%，但与最近的分离株只有93%～94%的一致性。可惜的是，没有研究去描述两组病毒抗原差异的特性。

有证据表明新城疫疫苗在一些特殊的条件下会没有效果。另外，自2005年以来，已经发现在后备种鸡持续的暴发新城疫强毒株感染，免疫接种良好，具有高水平新城疫抗体的禽类出现产蛋水平下降（Castilla and colleagues, 2009 ANECA abstract），这与韩国出现的产蛋问题非常相似（Cho et al., 2008b）。没有临床征兆，通过病毒的分离和组织病理学确证为新城疫强毒株。

六、结论

由于新城疫病毒具有高度的感染性以及临床症状与高致病性禽流感相似，准确的监控和快速的诊断鸟类的感染对于任何控制和扑灭程序具有至关重要的作用。积极主动的检测野鸟和家禽生产基地应该增加我们对NDV病毒的进化的理解。活禽交易市场有特别重要的意义，因为那里使多种不同品种的鸟类混合在一起，并提供了一个储存物种的环境，例如，水禽跟鹌鹑饲养在附近。在检测新城疫强毒株方面仍具有许多挑战。快速的检测和区分具有挑战，因为新城疫病毒存在显著的基因多样性和经常不能区分疫苗和地方性毒株。另外，分析系统进化树揭示新城疫病毒的弱毒株和强毒株仍在不断进化。我们需要改良监测方法，增加对野鸟和国内家禽新城疫病毒的生态学的理解和特异的诊断方法来识别新城疫病毒所有不同的基因型。