基于HIV基因组学研究中西药合用治疗艾滋病作用机制的探讨和思考＊

李艳萍，温 敏，赵 竞，赵 远

（云南省中医中药研究院，云南 昆明650223）

艾滋病全称为获得性免疫缺陷综合征（acquired i mmun m deficiency syndr o me，AIDS），该病由感染人免疫缺陷病毒（hu man i mmunodeficiency virus，HIV）而引起，导致被感染者免疫功能的部分或完全丧失，CD4细胞数量减少，功能降低，继而发生多系统、多器官、多病原体的复合感染（机会性感染）和肿瘤等，临床表现形式多种多样。艾滋病至今无法治愈，严重危害人类的生命健康，如何防治艾滋病一直是世界关注的热点，针对引起艾滋病的主要病毒——人免疫缺陷病毒（hu man i mmunodeficiency vir us，HIV）的干预、清除研究也是国内外科学家探索治疗艾滋病的策略方向。

1 HIV的病毒特征及性质是其目前无法从人体完全清除的根本原因，病毒基因是决定其特征和性质的关键，对HIV基因组序列分析，可反应病毒遗传变异调控信息，从而找到清除HIV的突破点。

HIV是一种逆转录RNA病毒。HIV侵入人体后，在病毒逆转录酶、病毒体相关的DNA多聚酶的作用下，病毒RNA先反转录成c DNA（负链DNA），构成RNA－DNA中间体。中间体中的RNA再经RNA酶H水解，而以剩下的负链DNA拷贝成双股DNA，逆转录过程线性DNA分子进入胞核并在病毒插入酶的催化下插入宿主DNA，成为细胞染色体的一部分。感染细胞后病毒的基因组序列可以通过逆转录整合到宿主的基因组当中。当宿主细胞转录激活，HIV的病毒基因也一起被转录。但由于HIV的病毒基因在选择性压力下存在高水平的遗传变异性，其自身的逆转录酶忠实性差，同时在人体免疫应答和抗病毒药物的作用下病毒易出现突变和重组现象，形成变异－整合－转录－变异的循环链，故多年来艾滋病的防治及疫苗的研究并未取得突破性进展。高效抗逆转录病毒治疗（HAART）是目前治疗艾滋病的主流方法。医学界曾一度寄希望于通过HAART治疗彻底清除人体内的HIV病毒，从而根治艾滋病。然而有许多证据表明，接受HAART并且血浆病毒水平已经被抑制到检出限以下的感染者体内，仍然进行着低水平的病毒复制。

随着基因工程研究的深入，部分临床实验室工作者和基础科学研究人员开始注意到基因治疗中的应用潜力。国内外的科学家们都试图以HIV病毒基因遗传变异调控的变化为目标探索清除HIV的主要措施和策略。而基因治疗的前提是我们要对艾滋病患者的基因组特征及病毒进化和传播关系有充分的了解。一些研究人员通过基因片段及单位点的分析，解码过艾滋病病毒基因组某一小部分的遗传信息［1～5］，不同治疗措施对HIV－1病毒某些基因片段或位点的作用也被研究过［6～12］。直至2009年8月美国科学家凯文·威克斯等［13］在NATURE杂志上发表了《HIV－1病毒RNA基因组的体系结构和二次结构》一文，HIV－1病毒的全基因组的编码及结构才被真正完全破解。由此，抗HIV的药物及治疗措施的研究目标也由原来的单片段单位点转移到了基因组序列。病毒基因组测序是了解病毒基因遗传变异调控信息的最直接方法，能够更真实反映病毒进化和传播关系。

2 中医药、中西医药合用对艾滋病的疗效已经广泛报道，我们也从病毒基因水平探讨了中药与HAART联用治疗，纯HAART治疗，纯中药治疗对HIV－1病毒基因表达调控的影响作用，但以不同治疗策略下群体HIV－1病毒基因组序列变化差异为目标来研究作用机制的，国内外未见报道。

我国治疗艾滋病的策略主要有三种：中药与HAART联用治疗，纯HAART治疗，纯中药治疗。三种治疗策略广泛使用后的疗效报道表明，纯HAART治疗可显著抑制患者血浆中的HIV病毒量而发挥疗效，但存在一定的毒副作用。纯中药治疗在改善症状体征及提高免疫功能方面有明显作用，延迟HIV－1感染者进入AIDS期［16］，但在抗病毒方面不能使体内的HIV－RNA降低到检测下限的水平。中药与HAART联用可互补而起到缓解毒副作用，增强免疫功能，减少存储病毒释放表达的效果，疗效优于纯HAART、纯中药治疗，国内很多学者从免疫水平探讨了三种治疗策略对艾滋病患者免疫功能的影响进而阐释不同治疗机制。我们也从病毒基因水平探讨了中药与HAART联用治疗，纯HAART治疗，纯中药治疗对HIV－1病毒基因调控表达的影响作用［17～20］。

从基因水平初步比较了中药与HAART联用治疗、纯HAART治疗对HIV－1病毒基因表达的影响作用［17～19］，将127例患者随机分为2组，分别为HAART＋安慰剂组（n＝62例），HAART＋康爱保生丸组（n＝65例），在治疗前及治疗后3，6，12月检测所有患者全血中HIV－1中gag，env、gag－pol基因的相对表达量，结果显示：在HIV－1RNA有效抑制下，结果可见在第3个月治疗HAART＋康爱保生丸组的HIV前病毒DNA的pol相对拷贝数和HAART＋安慰剂组有显著性差异（P＜0.05），在12月治疗过程中HAART＋康爱保生丸组的env、gag，pol基因的相对拷贝数基本都比HAART＋安慰剂组低。提示中西医药合用对HIV－1的env、gag，pol基因表达有一定影响作用。

从基因水平探索了纯中药治疗是否对HIV－1病毒tat，rev，nef，vpr，vpu，vif的基因表达有所影响［20］，我们随机抽取在本院艾滋病临床研究室接受中医药治疗的HIV感染者39例进行横断面调查。其中9例从未参与过任何治疗的患者（空白组）；30例患者接受纯中医药治疗——21例治疗时间小于12个月（短期治疗组）；9例治疗时间大于12个月（长期治疗组）。39例患者均为本院收治的背景资料详实，依从性较好的HIV感染者，在治疗期间一直服用康爱保生丸。对39例艾滋病病毒感染者的HIV病毒tat，rev，nef，vpr，vpu，vif的蛋白表达量的测定及组间比较显示，治疗组rev、tat及vpr的蛋白表达量显著低于空白组，（P＜0.05），治疗长期组Tat的蛋白表达量显著低于治疗短期组（P＜0.05）。根据tat，rev，vpr三种蛋白的功能和作用，该三种蛋白表达的下调对HIV的复制，细胞毒性会产生一定的抑制作用。初步研究显示，中医药可能对tat，rev，nef，vpr，vpu，vif具有一定的影响作用，提示中医药体内抗HIV的作用机制可能是干预HIV病毒tat，rev，nef，vpr，vpu，vif的蛋白表达量，进而导致HIV病毒的复制能力及细胞毒性下降或缺失，患者能长期带毒生存。

对于生物体来说，基因表达调控信息隐藏在基因序列的上游区域，在组成上具有一定的特征，可以通过序列分析识别这些特征，HIV病毒也不例外，已有研究显示HIV病毒基因组序列的变化与基因表达、转录、复制、调控密切相关，进而影响疾病进程。通过单位点片段基因多态性分析纯HAART治疗下病毒的耐药变异研究显示：HIV病毒基因呈高突变以抵抗抗病毒治疗的药物压力，已经确定的与6类艾滋病抗病毒药物耐药的有关HIV基因突变有200多个，其中50多个逆转录酶（Reversetranscriptase，RT）基因的突变与核苷类逆转录酶抑制剂（Nucleosid reverse transcriptase inhibitor，NRTIs）的耐药有关，包括M184 V、TA Ms、非核苷类似物的耐药相关突变，多核苷耐药性突变以及一些附属突变；40多个RT基因的突变与非核苷类逆转录酶抑制剂（Non－nucleoside reverse tran－scriptase inhibitor，NNRTIs）的耐药有关，包括主要的原发和继发突变，非多态性次要突变以及多态性附属突变；60多个突变与蛋白酶抑制剂（Protease inhibitor，PIs）的耐药有关，耐药变异对病毒的生物学特性产生了不同程度的影响［21～35］。通过全基因组序列分析HIV病毒在选择性压力下的变异情况的研究也有相关报告［36～39］。但这些位点或序列的变异研究仅处于横断面，未对病毒基因组进行不同时间点变化情况的分析研究。而中药联用HAART治疗、纯中药治疗下，HIV－1病毒基因组变异情况；以不同治疗策略下群体HIV－1病毒基因组序列变化差异为目标来研究作用机制的，国内外未见报道。

3 通过研究中医药、中西医药合用治疗时，HIV病毒基因组序列的变异规律，探索多位点变异和治疗方法的内在联系，对从病毒基因水平阐释不同治疗策略的抗HIV作用机制有重要意义，在分析HIV－1基因的致病能力、分子流行病学和开发靶向抗病毒药物及疫苗具有积极的应用前景。

目前，由于尚无大样本HIV－RNA病毒基因组变化的基础信息，人们对HIV－1的基因变异规律及其与宿主免疫系统相互作用的过程缺乏相对完整认识，不能全面揭示HIV－1全基因组遗传变异与疾病进展的内在联系。己有的研究大多数是探讨HIV－1基因中某一部分的变异情况与病情演变的关系，并没有对不同群体样本基因组序列变化情况进行研究。虽然欧美国家对于其流行的毒株己有了一定的研究，但目前在国际HIV序列数据库收录的1800条HIV病毒近基因组序列中，只有46条是来自中国，同时，获得病毒基因全序列的技术方法也有待改进，因此如何确保得到的全长基因完整性成为现今急需解决的问题。

通过研究不同治疗策略下，HIV病毒基因组序列的变异规律，构建大样本HIV－1基因组序列数据库，可在HIV－1病毒组学方面获得以下重要信息：

基因组学方面，可对同月份不同治疗策略所取样本进行基因组与HIV Database做比对，发现snp，indel位点，水平基因转移的发生，并进一步研究这些位点的变化，对病毒致病性，耐药性的影响；对所有病毒的基因组进行core and pan geno me分析，发现HIV病毒的保守基因，作为药物治疗研究的潜在基因靶位点；对所有月份病毒基因组与HIV Database做比对，使用treebest软件进行系统发育构建，并进行Ka／ks分析，对HIV病毒的系统发育及不同选择压力下变异的情况进行研究。RNA病毒变异很大，在同个样品中存在类似“种群”的多种亚型，通过高深度测序，测得尽可能全面的亚型后，分析在不用样品中各种不同“亚型”的分布比例。通过生物信息学方法的比较，获得每个样品中种群变化的信息，全面关联药物使用让HIV的变化，包括主要“亚型”的变化，“亚型”组成的变化等，分析药物对HIV可能作用的位点，并探索在不同选择压力下，HIV进化、变异的区别。

转录组学方面，可对相同月份，不同的治疗策略下的病毒样品进行转录组研究，发现致病性较强的病毒与致病性较弱的病毒基因表达的差异，结合患者及病毒的特点，发现导致致病性减弱的原因，并作为治疗HIV病毒侵染的可能手段。

基于以上的结果分析，可发现HIV－1感染者接受不同干预措施后HIV－1基因组序列差异，初步分析多位点变异和治疗方法的内在联系，我们可从病毒基因水平阐释不同治疗策略的抗HIV作用机制，探索抗HIV病毒新的和可能的靶点，为中西医结合治疗艾滋病提供临床应用的基础支持，为我国HIV－1感染的预防、诊断、监测和治疗提供重要的基础数据，在分析HIV－1基因的致病能力、分子流行病学和开发靶向抗病毒药物及疫苗具有重要的应用前景。

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