超氧化物歧化酶(Val16Ala)基因的克隆及其真核表达载体的构建

王 华，王九辉，谭光宏

(海南医学院海南省热带病重点实验室，海南 海口 571199)

·论 著·

超氧化物歧化酶(Val16Ala)基因的克隆及其真核表达载体的构建

王 华，王九辉*，谭光宏

(海南医学院海南省热带病重点实验室，海南 海口 571199)

目的 获得锰超氧化物歧化酶(MnSOD)基因并进行Val16Ala(GTT→GCT)位点的定点突变，构建MnSOD(Val)及MnSOD(Ala)基因的真核表达载体。方法 采用RT-PCR法从人乳腺癌细胞MCF-7中扩增MnSOD(Val)基因；PCR引物延伸法对Val16Ala进行定点突变以获得MnSOD(Ala)基因；通过EcoRⅠ+XhoⅠ双酶切PCR产物与相应质粒pEGFP-N1连接构建两基因的真核表达载体pEGFP-N1-MnSOD(Val)和pEGFP-N1-MnSOD(Ala)。结果 突变位点经测序证明正确，重组质粒经双酶切及测序鉴定证明正确。结论 本实验成功获得了MnSOD(Val)及MnSOD(Ala)基因并成功构建了两基因的真核表达载体。

MCF-7；MnSOD；Val16Ala；真核表达载体

锰超氧化物歧化酶(MnSOD)是位于线粒体内的抗氧化酶，通过调节体内ROS水平影响乳腺癌的进展及多种抗癌药物的效应。MnSOD的Val16Ala基因多态性具有功能性改变且发生频率高，与乳腺癌的发生及预后相关。为了分析Val及Ala两等位基因过表达后对乳腺癌细胞MCF-7功能及基因表达的差异以及化疗药物敏感性的差异，本研究在获得MnSOD基因野生型的基础上，首先对MnSOD基因进行第16位氨基酸的点突变，即GTT突变为GCT，然后构建了MnSOD(Val)及MnSOD(Ala)基因的真核表达载体，以期为进一步研究Val16Ala多态性对乳腺癌进展及化疗敏感性的影响打下坚实的基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株与质粒 人乳腺癌细胞MCF-7购自中国典型培养物保藏中心。携带EGFP基因的真核表达质粒pEGFP-N1为本实验室保存。

1.1.2 药品与试剂 细胞培养用DMEM及胎牛血清FBS购自GIBCO公司，0.25%胰蛋白酶购自AMESCO公司；RNA提取试剂TRIzol购自Invitrogen公司，AMV逆转录酶购自Promega公司；ExTaq、T4DNA连接酶、EcoRⅠ、XhoⅠ及DL2000DNA Marker均购自TAKARA公司；所用引物根据GeneBank中序列号为NM_000636的cDNA序列(669bp)设计并均由上海生工合成；PCR产物纯化试剂盒QIAquick PCR Purification Kit、胶回收试剂盒MinElute Reaction Cleanup Kit均购自QIAGEN公司。DNA Ladder购自碧云天生物技术研究所。所用化学试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 DMEM培养液含10%FBS，于37℃、5%CO2培养箱中培养，待细胞融合至80%，用于后续实验。

1.2.2 RT-PCR 采用TRIzol裂解细胞，提取细胞总RNA，两步法扩增MnSOD cDNA全长基因。首先，逆转录按20μL体系进行。体系中含RNA样品11μL、Oligo dT(18)2μmol/L，于65℃保温5min，然后冰浴5min；随后往上述体系中依次加入RNase抑制剂(40U/μL)0.5μL、10×AMV 反应缓冲液 2μL、dNTP(10μmol/L)2.5μL及AMV逆转录酶2μL，轻轻混匀后于42℃水浴1h，再于70℃水浴15min终止反应，产物存于-20℃。扩增MnSOD cDNA全长基因所用引物为P1(TCAGAT CTCGAG ATGTTGAGCCGGGCAGTGT，1～19bp)、P2(CTGCAGAATTC CTTTTTGCAAGCCATGTATC，647～666bp)。扩增条件：95℃预变性5min；94℃ 40s，51℃ 1min，72℃ 1min，30个循环；72℃延伸5min。1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。此时获得的基因型为MnSOD(Val)。

1.2.3 Val16Ala点突变 Val16Ala点突变即为编码Val的密码子GTT点突变为编码Ala的密码子GCT。以上述MnSOD(Val)基因RT-PCR产物纯化后为模板，P4(CAGC AGGCAGCTGG CTCCGGCTTTGGG，27～53bp，红色标记处为突变位点)与P2为引物做PCR，对MnSOD(Val)基因进行点突变；第一次PCR产物纯化后作为模板，以P3(CC GGGCAGTGTG CGGCACCAGC AGGCAG，8～36bp)与P2为引物做PCR，即延伸反应；再将第二次PCR产物纯化后作为模板，P1与P2为引物做第二次延伸反应，以获得全长的MnSOD(Val16Ala)点突变序列。PCR扩增条件为：94℃预变性4min；94℃ 40s，55℃ 1min，72℃1min，28个循环；72℃延伸6min。1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。此时获得的基因型为MnSOD(Ala)。

1.2.4 载体构建 取上述纯化的PCR产物[Mn-SOD(Val)、MnSOD(Ala)]，分别用EcoRⅠ+XhoⅠ双酶切，并同时双酶切真核表达质粒pEGFP-N1。酶切产物切胶回收后于16℃连接过夜，连接产物经CaCl2法转化宿主菌NovaBlue，并以卡那霉素作为抗性筛选标记。碱裂解法小量提取质粒并用EcoRⅠ+XhoⅠ双酶切鉴定阳性转化子。本试验中所有DNA重组操作均按《分子克隆试验指南》第3版[1]的方法进行。

1.2.5 突变位点的鉴定 取上述实验筛选出来的阳性克隆样品菌液，送测序，测序引物为GGAGGTCTATATAAG(该序列位于质粒多克隆位点上游部分)。

2 结 果

2.1 电泳结果 MnSOD(Val)、MnSOD(Ala)基因的获得PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测结果见图1，所得产物在669bp处，符合实验预期。

图1MnSOD基因PCR扩增结果

2.2 真核表达载体的构建 MnSOD(Val)、Mn-SOD(Ala)型基因分别与载体pEGFP-N1连接、转化，EcoRⅠ+XhoⅠ双酶切鉴定阳性转化子。鉴定结果如图2所示：已获得两种基因型的重组质粒。

图2 重组质粒的EcoRⅠ+XhoⅠ双酶切鉴定结果

2.3 突变位点的鉴定 取上述结果中1号样品与6号样品菌液送测序，测序结果经生物学软件DNAMAN比对以检查其突变位点。比对结果见图3，Mn-SOD(Ala)基因型中的GTT已经成功突变为GCT，符合实验预期。测序结果也证明了载体构建是正确的。

图3DNAMAN比对结果

3 讨论

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其风险因素包括年龄、家族史、生育、月经史以及肥胖等。近年来发现锰超氧化物歧化酶(MnSOD)基因的Val16Ala多态性与乳腺癌的发生及预后具有相关性。MnSOD在线粒体内发挥对氧自由基的清除作用，是一种非常重要的抗氧化酶。该基因敲除的小鼠表现出线粒体的功能紊乱，并产生致命后果，相反，过表达MnSOD则对线粒体有保护作用[2]。MnSOD基因的Val16Ala多态性位于信号肽的第16位氨基酸处，其在将Mn-SOD靶向定位于线粒体中起关键作用。信号肽16位氨基酸为Ala时线粒体中的MnSOD含量明显高于Val存在时的含量[3]。

有研究表明，乳腺癌的进展与体内ROS和抗氧化系统的平衡失调有关[4]。ROS是一种重要的信号分子，可调节细胞的分化、增殖、转化及凋亡，但过高的ROS可对细胞产生毒性作用[5]。MnSOD通过调节线粒体内的ROS水平，防止细胞收到氧化压力的损伤，从而对肿瘤的病理生理过程产生影响。另外，MnSOD表达水平的变化还可导致抗癌药物疗效及不良反应的差异。例如，抑制MnSOD表达可提高卵巢癌细胞对阿霉素和紫杉醇的敏感性；阿霉素与重组MnSOD联合用药可提高对乳腺癌细胞和小鼠实体瘤的疗效；MnSOD水平升高可使消化道肿瘤细胞对阿霉素和丝裂霉素C的敏感性下降；MnSOD对阿霉素的心脏毒性具有保护作用等[6-9]。因此，明确MnSOD基因的Val16Ala多态性对乳腺癌进展及化疗敏感性的影响意义重大。本研究在成功获得突变体的基础上构建了MnSOD(Val)及MnSOD(Ala)基因的真核表达载体pEGFP-N1-MnSOD(Val)和pEGFP-N1-Mn-SOD(Ala)，以期在MCF-7细胞中稳定表达后为进一步研究Val16Ala多态性对乳腺癌进展及化疗敏感性的影响打下坚实的基础。

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Cloning of manganese superoxide dismutase gene(Val16Ala)and the construction of its eukaryotic expression vector.

WANG Hua,WANG Jiu-hui*,TAN Guang-hong.Hainan Provincial Key Laboratory of Tropical Medicine,HainanMedical University,Haikou 571199,Hainan,CHINA

Objective To clone manganese superoxide dismutase gene(MnSOD)and the site-directed mutation for Val16Ala(GTT→GCT),then construct eukaryotic effective expression vector with the two genotypes.Methods Firstly,we cloned gene MnSOD(Val)from the total RNA of human breast carcinoma cells MCF-7by RT-PCR and the site-directed mutated mutation for Val16Ala(GTT→GCT)by overlap extension using PCR to acquire genotype MnSOD(Ala).Secondly,the two genotypes digested byEcoRⅠ andXhoⅠ,and then ligated to expression vector pEGFP-N1to construct the plasmid pEGFP-N1-MnSOD(Val)and pEGFP-N1-MnSOD(Ala).Results Mutation site were proved correctly by sequencing,and the recombinant vectors were proved to contain the expected inserts by double digestion with restriction enzymes and sequencing.Conclusion Two genotypes MnSOD(Val)and MnSOD(Ala)have been cloned,and two eukaryotic expression vectors containing the two genes have been constructed successfully.

MCF-7;MnSOD;Val16Ala;Eukaryotic expression vectors

R394

A

1003—6350（2012）16—001—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2012.16.001

国家自然科学基金(编号：81060276)

王 华(1980—)，女，重庆市人，助理研究员，硕士。*

王九辉，副教授。E-mail：wangjh3@tom.com

2012-05-08)