药源性特异质肝损伤及其发生机制的研究进展

苏怡菁， 江振洲，2， 张 云， 张陆勇，3*

(1.中国药科大学江苏省新药筛选中心，江苏南京210009;2.中国药科大学药物质量与安全预警教育部重点实验室，江苏 南京210009;3.中国药科大学 江苏省药效学研究与评价服务中心，江苏南京210009)

20世纪90年代初，药物开发失败的主要原因是其难以预测的药动学特征［1］。随着药动学研究的发展，药物的动力学特征日渐易于被预测，不良反应转而成为药物开发失败的主要原因。如溴芬酸(Hunter E B等，Am JGastroenterol，1999年)和曲格列酮(Kohlroser J等，Am JGastroenterol，2000年)因药源性肝损伤(drug induced liver injury，DILI)等不良反应而遭撤市，利培酮、曲伐沙星、奈法唑酮等也因此被美国FDA列入警告药物名单［2-3］。

DILI是一类较为严重的药物不良反应，占药物不良反应的10% ～15%［4］，占所有急性肝损伤的50%以上［5］，包括可预测的DILI和不可预测的DILI两大类。对于可预测的DILI，其机制包括破坏细胞内钙离子稳态、胆汁淤积、活性代谢物毒性、免疫毒性［6］、直接触发细胞凋亡以及破坏线粒体功能等［7］;不可预测的DILI即为药源性特异质肝损伤(idiosyncratic drug induced liver injury，IDILI)，是发生频率最高、最值得引起重视的药物特异质反应(idiosyncratic drug reaction，IDR)。

IDR仅发生在少数用药者身上(发生率通常低于5%)，与药物的药理效应无关［8］，且与临床剂量无明显关系［9］，而与患者年龄、性别、身体状态及是否饮酒等因素相关［10］，其产生有暂时性和非连续性的特点(Zimmerman H J，Dis Mon，1993年)，较易发生于年老者、女性、炎症患者和饮酒者［11］，是药物、用药者自身状况和环境综合作用的结果。IDR发生概率较低，药物的临床前研究通常无法预测其发生［12］，其既可能在患者首次或第2次接触药物后发生，也可能在经历数周甚至数月后发生。该类反应涉及人体的各个器官，由于肝脏在药物代谢过程中处于中心地位，故其成为最易产生IDR的器官［13］。

随着人们对可预测的DILI的深入研究，因传统的药物肝毒性而遭撤市的药物已日趋减少，IDILI则受到越来越多的关注。然而，由于现有的检测体系尚难以预测IDILI的发生，一旦一种很有开发前景的新药被发现可引起IDILI，将导致制药公司的巨大损失，且此损失不仅表现在经济上，还表现在诸如企业信誉之类无形资产的损害上，其对受试者带来的伤害更是难以估量。鉴于此，预测药物产生IDILI的风险，发现IDILI的可能的标志物，已成为新药研发中的热点［14］。虽然目前对IDILI的发生机制尚不明确，研究人员仅从代谢、免疫等角度提出了一些假说;但一些可用于此项研究探索的特异质肝损伤的动物及细胞模型正在逐步建立。

1 药源性特异质肝损伤的可能机制

从目前的研究来看，IDILI更多的是对一种现象的命名，其机制并不明了。经过长期摸索，人们就IDILI的发生机制提出了若干假说，虽然这些假说之间存在着某些内在联系，但每一种假说均只涉及IDILI的某一个或几个方面，至今仍无一种假说能够对IDILI的机制作出全面的解释，故应综合这些假说来探讨某个药物的IDILI。

根据目前的假说，大体可将IDILI的发生机制分为代谢特异质和炎症特异质。其中，代谢特异质主要与代谢酶的基因多态性有关［15］;炎症特异质则解释了排除代谢差异后IDILI发生的主要机制［16］，由于炎症反应的广泛存在性，大多数研究都采用轻度炎症模型来模拟IDILI现象。

1.1 炎症应激假说

Roth等(Toxicol Appl Pharmacol，1997年)提出，当体内发生急性炎症刺激时，药物诱导的肝毒性会发生改变，此时机体更易出现IDILI。中等强度的炎症刺激可降低机体对药物产生肝毒性的应答阈值，使药物治疗窗变窄，即药物在一个本应安全的剂量下产生毒性反应;而药物的存在反过来亦可扩大炎症应激的损伤，使原本轻微的炎症反应造成较严重的后果。由此可见，炎症与IDILI之间的关系可从两方面来看:一方面，IDILI常伴有炎症反应的发生;另一方面，轻度的炎症反应可增加患者对药物毒性的敏感性。

人及动物中的炎症反应非常普遍，且许多情况下(如改变膳食习惯、饮酒、胃肠刺激和外科手术等)常伴有轻度的炎症介质释放，因此，某些患者可能因在用药时伴发炎症而出现特异质反应。有研究发现，少量脂多糖(LPS)可诱发轻度炎症，而LPS与炎症细胞表面的Toll样受体4作用后，数小时内即可引起单核细胞和巨噬细胞浸润、基因表达的改变和多种炎症介质或细胞因子的激活，最终通过旁分泌或体循环作用于其他组织细胞，引起全身炎症反应综合征。少量LPS进入肝脏后，可通过激活枯否细胞(Kupffer细胞)等而被直接吞噬，而大量LPS则可导致休克、多器官功能衰竭和死亡［17］。

1.2 活性中间代谢产物假说

Kaplowitz等(Ann Intern Med，1986年)提出，药物在机体中代谢生成的活性产物会与细胞膜上重要的蛋白共价结合，破坏膜完整性，造成细胞内钙离子紊乱等问题。与正常个体相比，对药物敏感的个体可能因体内代谢酶的基因多态性，使得药物的活性中间代谢产物的种类和生成量发生变化。糖尿病治疗药物曲格列酮便是通过活性中间代谢物产生毒性的一个典型例子，其在肝内被细胞色素 P450酶CYP3A4代谢为5种主要的活性产物，后者通过耗竭谷胱甘肽，并与蛋白及其他亲核物质结合［18］，造成肝脏损伤。然而，研究发现，许多药物的活性代谢产物并未显示出比其原形药物更高的肝毒性，故而可推测活性中间代谢产物只是某些药物产生IDILI的原因，但未必是所有IDILI发生的原因［8］。

1.3 基因多态性假说

基因多态性假说与活性中间代谢产物假说存在某些相似之处，即都是个体代谢酶的基因多态性及其导致的对药物代谢的差异:若某个体的某种药物代谢酶水平偏低，则会造成此药在个体体内的代谢速率降低，若此药物原型比代谢物毒性更大，该个体表现出的毒性反应便更强烈［19］。基因多态性影响毒性的经典药物是抗结核药物异烟肼［20］。曾有研究发现，不同种族的人群由于基因的多态性，致使其体内乙酰转移酶的含量不同，乙酰化速率不同，异烟肼的代谢速率便不同。据此出现快代谢和慢代谢人群之说，其中快代谢人群发生肝毒性的概率大于慢代谢人群［21］。

另外，Gurumurthy等(Am Rev Respir Dis，1984年)还发现，由于体内代谢酶水平的差异，即使不同个体摄入相同剂量的同种药物，到达毒性阈值的时间也会不同，故毒性出现的时间也不同。基因多态性可决定部分药物的IDILI效应，但同样也不是导致IDILI的唯一原因［22］。

1.4 半抗原假说

半抗原假说由Robin等(J Hepatol，1997年)提出，近年来颇受关注。该假说认为，某些化学活性物质或活性代谢产物等小分子化合物本身并不能刺激抗体产生，当与人体细胞内的蛋白共价结合并形成复合物后则有可能被自身免疫系统视为外源性抗原，当机体继续暴露在药物环境中时，便会发生快速的免疫反应，导致由B细胞介导的自身抗体的生成和T细胞的激活，最终造成细胞损伤，这种小分子化合物被称为半抗原。Parker等(Pharmacol Rev，1982年)指出青霉素导致的特异质损伤便与致病性抗体免疫球蛋白E(IgE)相关，青霉素的β内酰胺环可与体内蛋白结合形成抗原，与IgE抗体作用，导致肥大细胞脱颗粒，释放组胺、白介素(IL)等物质，从而造成组织损伤。

但是，目前的研究结果尚不能明确与药物及其活性代谢产物结合的体内蛋白种类以及其中可致药物产生严重毒性反应的蛋白。

1.5 危险因子假说

危险因子假说与半抗原假说有一定关联性。该假说认为，当药物或其代谢产物与蛋白相结合并同时有一种或多种应激信号产生时，免疫损伤才会形成，而相应的应激信号即为“危险因子”［23］。这些危险因子的种类目前并不清楚，它们有可能是内源性的，并因个体的不同而不同。这些信号可以是轻度的炎症反应及其间释放的细胞因子，细胞因子则可激活获得性免疫系统，而药物的继续使用便会造成肝脏损伤［24］。

1.6 线粒体失调假说

研究发现，某些能够导致IDILI的药物(如曲格列酮、托卡朋、双氯芬酸、异烟肼等)可使机体出现三磷酸腺苷水平下调、活性氧增加以及线粒体膜电位下降等线粒体功能失调现象［25］，且其他外源毒性物质、缺氧、炎症等因素也可改变线粒体功能，从而改变细胞对药物的敏感性，导致IDILI的产生［26］，因此，线粒体功能失调可能是IDILI产生的一个重要原因。

1.7 适应性缺失假说

对于某一药物而言，可能其大部分使用者仅产生轻度、可逆的肝毒性，即对药物产生了适应性，而另一小部分人则不能适应，最终发展为明显的毒性反应，表现为特异质损伤，这部分人群即被认为存在适应性缺失［27］。例如，Mushin等(Br Med J，1971年)发现，在使用氟烷作为麻醉剂的病人中，20%会产生轻微、可逆的肝损伤，而仅有0.005%的病人发展成肝硬化。

目前对于适应性缺失这一现象背后的原因所知甚少，推测用药者对药物的耐受能力可能与环境或基因因素相关。这一假说可与基因多态性假说相互印证，例如某种抗炎细胞因子或抗凋亡蛋白的多态性可使某些个体不能够适应微小的机体伤害而导致严重损伤产生［19］。

2 药源性特异质肝损伤的研究方法

目前，对IDILI的研究大多采用基于炎症应激假说而制备的动物轻度炎症模型，通常的方法是:先通过尾静脉注射LPS使受试动物处于轻度炎症状态，而后再给予受试药物，以模拟临床上IDILI发生时的状况。近年来，由于对高通量筛选可致IDILI的药物的需求的增加及相关技术的进步，一些体外模型也逐步被建立［28］。

2.1 体内研究方法

动物的体内研究对于探索IDILI的发生机制有着不可替代的作用，理想的动物模型的建立对于实验研究十分重要［19］。然而，目前用于研究IDILI的大多数动物模型都存在一定缺陷，且没有一种动物模型能够独立预测药物产生IDILI的可能性，或预测特定病人对某一药物产生特殊反应的可能性［29］。而且，由于免疫系统的复杂性，拟建立与自身免疫相关的IDILI动物模型更是困难。

Roth等(Toxicol Appl Pharmacol，1997年)发现，对动物同时给予LPS和安全剂量的肝毒性药物可导致肝脏损伤，其中被研究较早的肝毒性药物包括雷尼替丁等。雷尼替丁可导致血液中转氨酶升高，但只在极少情况下导致肝脏衰竭。体内实验显示:将雷尼替丁与少量LPS联用时，LPS能激活中性粒细胞，随后，雷尼替丁引发免疫反应，诱使机体释放大量炎症因子并攻击正常肝细胞，造成肝脏损伤，这一结果在几小时内即可显现。

对乙酰氨基酚(APAP)是经典的药源性肝损伤药物，目前虽尚不十分清楚其致肝损机制，但有证据显示，免疫系统参与了APAP致肝损的过程。例如，Blazka等(Toxicol Pathol，1996年)发现，APAP造成肝脏损伤的严重程度与机体内巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、干扰素(IFN)-γ和肿瘤坏死因子(TNF)-α等细胞因子的水平呈正相关。Laskin等(Toxicology，2001年)提出，巨噬细胞的作用是APAP致肝损机制的一部分。体内研究显示:在给予APAP前2 h，给大鼠使用巨噬细胞功能抑制剂氯化钆(10 g·L-1)，可有效防止由APAP引起的大鼠肝脏小叶中心坏死，且肝毒性的传统指标血清转氨酶也未出现显著性升高。然而，对于APAP在轻度炎症模型中的毒性作用，文献报道结果并不一致:Ganey等［30］指出LPS会显著增加APAP的肝毒性，而Liu等(Toxicology，2000年)则认为LPS的存在可使APAP的肝毒性降低。

氟烷在极少数情况下可导致较严重的特异质肝损。通常给予动物正常剂量的氟烷时并不会引发肝损，但Moult等(Proc R Soc Med，1975年)发现，预先给予苯巴比妥后再给予氟烷，会导致中度肝损伤。推测其可能的机制是，苯巴比妥可导致氟烷在代谢过程中释放大量的自由基，从而间接造成肝损。

2.2 体外研究方法

由于轻度炎症对肝细胞的损伤涉及多种细胞的相互作用，目前有关IDILI的体外研究模型尚不多见。Tukov等［31］报道，将大鼠枯否细胞与肝实质细胞联合培养并用作研究炎症在药物肝毒性中作用的体外模型。枯否细胞与肝实质细胞分离于同一只大鼠的肝脏，将2种细胞联合培养后分为3组，分别加入LPS、APAP或LPS+APAP，观察各组细胞变化，并测定炎症因子的分泌情况。结果发现，LPS+APAP组细胞中炎症因子的分泌增加最为明显，从而造成了最为严重的细胞死亡。提示在体内状态下，炎症的存在可能加重药物的肝毒性作用。此外，Cosgrove等［28］分别应用肝原代细胞和HepG2细胞系，加入LPS及TNF、IFNγ、IL-1α、IL-6等细胞因子，造成炎症模型，并运用这一模型大规模筛选具有潜在特异质肝损伤作用的药物。将待筛选的90个药物分别与LPS及细胞因子同时加入细胞培养基中，测定药物对细胞增殖的抑制率。结果显示:19%的药物与LPS联用后对细胞增殖的抑制率提高。提示这些药物存在潜在的特异质肝毒性。

3 总结与展望

目前对于IDILI的研究仅停留在化学药物的范畴，尚不见对中药进行IDILI评价的报道。虽然中药反应中没有特异质反应的称谓，但其副作用确实存在因人、因时而异的现象。由于中药的成分复杂，作用靶点十分广泛，对于其副作用的把握也就显得十分困难。

如何界定中药的特异质肝毒性及探究其成因，都是一个全新的课题。中药的肝肾毒性是阻碍中药现代化与国际化的一个重要方面，在制药行业全面重视特异质肝损伤的今天，尝试对中药的特异质反应作一些探索性研究具有重要意义。

目前对药物特异质肝毒性的研究还处于起步阶段，已提出的各种理论尚不能全面解释临床遇到的各种情况，运用于临床前研究的动物模型和细胞模型也有待改进和增加。特异质肝损伤是与人体、药物、环境都有密切关系的特殊现象，关于它的研究需综合考虑多种因素的作用。在药物评价的初期阶段，就应考察药物可能存在的潜在的特异质肝损伤作用，这无论对于药物研发者还是患者，都有十分重要的意义。

［1］ Frank R，Hargreaves R.Clinical biomarkers in drug discovery and development［J］.Nat Rev Drug Discov，2003，2(7):566-580.

［2］ Lasser K E，Allen P D，Woolhandler S J，et al.Timing of new black box warnings and withdrawals for prescription medications［J］.JAMA，2002，287(17):2215-2220.

［3］ Thames G.Drug-induced liver injury:what you need to know［J］.Gastroenterol Nurs，2004，27(1):31-33.

［4］ Stickel F，Patsenker E，Schuppan D.Herbal hepatotoxicity［J］.JHepatol，2005，43(5):901-910.

［5］ Ostapowicz G，Fontana R J，Schiødt F V，et al.Results of a prospective study ofacute liver failure at17 tertiary care centers in the United States［J］.Ann Intern Med，2002，137(12):947-954.

［6］ Ju C，Reilly T.Role of immune reactions in drug-induced liver injury(DILI)［J］.Drug Metab Rev，2012，44(1): 107-115.

［7］ Lee W M.Drug-induced hepatotoxicity［J］.N Engl J Med，2003，349(20):474-485.

［8］ Uetrecht J.Idiosyncratic drug reactions:current understanding［J］.Annu Rev Pharmacol Toxicol，2007，47(7): 513-539.

［9］ Pasipanodya JG，Gumbo T.Clinical and toxicodynamic evidence that high-dose pyrazinamide is notmore hepatotoxic than the low doses currently used［J］.Antimicrob Agents Chemother，2010，54(7):2847-2854.

［10］ Chalasani N，Björnsson E.Risk factors for idiosyncratic drug-induced liver injury［J］.Gastroenterology，2010，138 (7):2246-2259.

［11］Lucena M I，Andrade R J，Kaplowitz N，et al.Phenotypic characterization of idiosyncratic drug-induced liver injury: the influence of age and sex［J］.Hepatology，2009，49 (6):2001-2009.

［12］Bell L N，Vuppalanchi R，Watkins P B，et al.Serum proteomic profiling in patients with drug-induced liver injury［J］.Aliment Pharmacol Ther，2012，35(5):600-612.

［13］Roth R A，Luyendyk JP，Maddox J F.Inflammation and drug idiosyncrasy-is there a connection?［J］.J Pharmacol Exp Ther，2003，307(1):1-8.

［14］Björnsson E，Jacobsen E I，Kalaitzakis E.Hepatotoxicity associated with statins:reports of idiosyncratic liver injury post-marketing［J］.JHepatol，2012，56(2):374-380.

［15］Amacher D E，The primary role of hepatic metabolism in idiosyncratic drug-induced liver injury［J］.Expert Opin Drug Metab Toxicol，2012，8(3):335-347.

［16］Zhang X，Liu F，Chen X，etal.Involvement of the immune system in idiosyncratic drug reactions［J］.Drug Metab Pharmacokinet，2011，26(1):47-59.

［17］李玉凤.细菌脂多糖对氯丙嗪、Z24肝毒性作用的影响［D］.北京:中国人民解放军军事医学科学院，2005.

［18］Uetrecht J.Evaluation of which reactive metabolite，if any，is responsible for a specific idiosyncratic reaction［J］.Drug Metab Rev，2006，38(4):745-753.

［19］ Shaw P J，Ganey P E，Roth R A.Idiosyncratic druginduced liver injury and the role of inflammatory stress with an emphasis on an animal model of trovafloxacin hepatotoxicity［J］.Toxicol Sci，2010，118(1):7-18.

［20］Tostmann A，Boeree M J，Aarnoutse R E，et al.Antituberculosis drug-induced hepatotoxicity:Concise up-to-date review［J］.J Gastroenterol Hepatol，2008，23(2): 192-202.

［21］Andrade R J，Lucena M I，Alonso A，et al.HLA class II genotype influences the type of liver injury in druginduced idiosyncratic liver disease［J］.Hepatology，2004，39(6):1603-1612.

［22］Andrade R J，Agúndez JA，Lucena M I，et al.Pharmacogenomics in drug induced liver injury［J］.Curr Drug Metab，2009，10(9):956-970.

［23］ Kaplowitz N.Idiosyncratic drug hepatotoxicity［J］.Nat Rev Drug Discov，2005，4(6):489-499.

［24］Waring JF，Anderson M G.Idiosyncratic toxicity:mechanistic insights gained from analysis of prior compounds［J］.Curr Opin Drug Discov Dev，2005，8(1):59-65.

［25］Kashimshetty R，Desai V G，Kale V M，et al.Underlying mitochondrial dysfunction triggers flutamide-induced oxidative liver injury in a mouse model of idiosyncratic drug toxicity［J］.Toxicol Appl Pharmacol，2009，238(2): 150-159.

［26］Watkins P B.Idiosyncratic liver injury:challenges and approaches［J］.Toxicol Pathol，2005，33(1):1-5.

［27］Roth R A，Ganey P E.Intrinsic versus idiosyncratic druginduced hepatotoxicity-two villains or one?［J］J Pharmacol Exp Ther，2010，332(3):692-697.

［28］Cosgrove B D，King B M，Hasan M A，et al.Synergistic drug-cytokine induction of hepatocellular death as an in vitro approach for the study of inflammation-associated idiosyncratic drug hepatotoxicity［J］.Toxicol Appl Pharmacol，2009，237(3):317-330.

［29］Zou W，Roth R A，Younis H S，et al.Neutrophil-cytokine interactions in a rat model of sulindac-induced idiosyncratic liver injury［J］.Toxicology，2011，290(2/3): 278-285.

［30］Ganey P E，Luyendyk J P，Maddox J F，et al.Adverse hepatic drug reactions:inflammatory episodes as consequence and contributor［J］.Chem Biol Interact，2004，150 (1):35-51.

［31］Tukov F F，Maddox J F，Amacher D E，et al.Modeling inflammation-drug interactions in vitro:A rat Kupffer cellhepatocyte coculture system［J］.Toxicol In Vitro，2006，20 (8):1488-1499.