膜联蛋白A1/A2膜聚集在肝源性肺血管重塑中的研究进展

曾 静，易 斌，鲁开智综述，王晓斌审校

0 引 言

肝源性肺疾病肺血管重塑是多种慢性肝病作用于肺的共同病理生理改变。在此过程中，肝源性刺激因子(多种细胞因子)诱导肺微血管内皮细胞(pulmonary microvascular endothelial cells，PMVECs)异常增殖和肌样分化［1－2］，引起肺微血管扩张(pulmonary vaso dilatation，PVD)，从而导致血管中层PASMCs处于低氧环境;PASMCs从高分化的收缩型转换为未分化的合成型，并从中膜迁移于内膜异常增殖，最终导致肺血管重塑［3］。研究表明，肺血管重塑涉及多条信号通路，并与细胞骨架及膜系统密切相关;而ANNXⅠ/Ⅱ的膜聚集在细胞内参与膜形成、膜转运、细胞骨架的调控等重要生命过程［4］。因此，ANNXⅠ/Ⅱ的膜聚集在肝源性肺血管重塑中可能起着关键性作用。本文对ANNXⅠ/Ⅱ的膜聚集在肝源性肺血管重塑中的研究进展作一综述。

1 ANNXⅠ/Ⅱ的结构

ANNX是一类结构相关钙依赖性磷脂结合蛋白超家族［5］，分布于各种组织细胞的细胞核、细胞质以及细胞质膜外表面，具有多种生物学功能［6］。迄今为止，在不同种属范围内，已发现160种以上的该家族成员，分为A(脊椎动物)、B(非脊椎动物)、C(单细胞真核生物)、D(植物)、E(原生生物)5组。脊椎动物细胞中的成员被定为膜联蛋白A家族，有13个成员即A1～A13。结构上都具有由70个氨基酸残基组成的4个保守重复序列结构(annexins A6有8个重复序列)，称为中心结构域，其内大约有40%～60%的氨基酸序列同源。不同的膜联蛋白具有独特的N端序列、独特的基因表达方式和组织特异性。ANNXⅠ的基因定位于人染色体9q12-q21.2，编码346个氨基酸残基，组成了相对分子质量为37 000的ANNXⅠ蛋白［7］;其N端有44个氨基酸残基，包含了磷酸化和蛋白水解位点，并以钙依赖的方式与S100A11蛋白相互作用［8］。ANNXⅡ的基因定位于人染色体15q21-q22，编码由339个氨基酸残基组成的相对分子质量为36000的ANNXⅡ蛋白;其N-端有31个氨基酸残基，包含S100A10蛋白(p11)和3个磷酸化位点(Ser11、Ser25、Tyr23)［9］。

2 ANNXⅠ/Ⅱ蛋白的膜聚集

目前的研究表明，炎症、缺氧、肿瘤等环境下，ANNXⅠ/Ⅱ的N-末端结构域从第3重复序列形成的疏水结构中释放出来，位于分子结构的凹面，通过与另1个ANNX的N-端螺旋形成二聚体，并与2个S100A11构成的二聚体连接起来，形成异四倍体样结构(膜-ANNX-S100A11-S100A11-ANNX-膜)，由此引起膜聚集;ANNXⅠ通过N-端肽段与磷脂结合而产生1个α-螺旋二级结构，肽段形成1个两性螺旋，一些侧链插入磷脂，螺旋轴与膜平行，提示在膜聚集过程中，N-端结构域可能提供第2个膜结合位点［10］。研究提示，annexins A2存在不同的聚集形式:Ca2+缺乏时，以“伸展”形式的聚集形成膜桥。Ca2+存在时，膜聚集发生更迅速;表现为 S100A10定位于分子复合物中心的“关闭”形式，或“开放”形式的聚集导致S100A10暴露，从而与其他蛋白相互作用［11］。膜聚集后的 ANNXⅠ/Ⅱ的多个磷酸化位点暴露，ANNXⅠ的N端第21位的Tyr残基被表皮生长因子受体(epidermal growth factor recrptor，EGFR)的酪氨酸蛋白激酶磷酸化，以及第27位的Ser残基被蛋白激酶 C(protein kmase C，PKC)磷酸化。ANNXⅡ的N端Ser11和Ser25均可在PKC作用下发生磷酸化，Tyr23可被PP60v-src或其他多种膜结合激酶磷酸化修饰，如胰岛素受体、胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)受体、血小板衍生生长因子(platelet deriving growth factor，PDGF)受体等。磷酸化的ANNXⅠ/Ⅱ向细胞表面［12］、细胞核［13］或细胞内膜转位［14］，从而在细胞信号转导、增殖、分化等方面发挥重要功能。ANNXⅠ/Ⅱ的膜聚集作用，在人体多种细胞内参与蛋白跨膜转运、蛋白运输、膜形成、细胞骨架的形成、胞吞胞吐、细胞增殖、细胞迁移、分化及凋亡等一系列重要的生命过程。

3 膜聚集在肝源性肺血管重塑中的作用

肝源性肺疾病PMVECs异常增殖和肌样分化，导致PVD;PVD是低氧血症的病理基础，而低氧作为主要的刺激因素，作用于 PASMCs，引起 ANNXⅠ/Ⅱ膜聚集，参与多条信号通路信息传递，调节细胞表型相关蛋白形成、转运，导致PASMCs表型转换，最终引起肺血管重塑。ANNXⅠ/Ⅱ可能是PASMCs表型转换分子机制的关键变化，是众多调节通路的“核心枢纽”，在肝源性肺血管重塑中发挥关键性调节作用。

3.1 调节重要信号通路蛋白的跨膜转运及运输 真核细胞的生长、分裂、生物合成、分泌等生命过程都伴随着蛋白质在各细胞器之间的膜转运、运输，这对于信号途径的传导、调节乃至细胞的生命活动都起到非常关键性的作用。受到刺激后，ANNXⅠ/Ⅱ膜聚集，其N-端尾巴磷酸化影响与C-端中心结构域的结合，导致对蛋白酶解易感性的改变，修饰钙敏感性和磷脂结合，其磷酸化调节囊泡运输。ANNX被酪氨酸激酶磷酸化，参与受体触发的胞吞作用和囊泡聚集［15］。研究表明，ANNXⅡ与囊泡释放也存在关联，ANNXⅡ增强肌动蛋白介导的囊泡释放，使肌动蛋白结合至含有负电荷磷脂的囊泡。采用siRNA，ANNXⅡ干扰导致囊泡释放减少，显示ANNXⅡ对囊泡形成具有重要作用［16］。ANNXⅡ功能性地替代甲基纤维素，提示其对促进肌丝生长的成核有作用，ANNXⅡ使F-actin连接至囊泡膜。从而使激素和神经递质与细胞表面受体相互作用，启动级联反应，信息传送至靶细胞内。这个信号转导过程，涉及连续的高度特异性的蛋白-蛋白相互作用。这些蛋白质可能形成可逆的蛋白复合物，以有序的方式在信号转导过程中使信息传送最大化。Creutz等［17］用原子力显微镜显现了复合物的结构在体外的动力学形成，反映细胞膜上的ANNX和copineⅠ，证实它们能招募其他信号或膜运输蛋白至膜表面;提示ANNXⅠ能改变膜结构，促进结构域形成，建立另外的结合空间与copineⅠ结合，进而copineⅠ在磷脂表面招募相互作用蛋白。ANNXⅠ/Ⅱ通过对囊泡运输的调节，参与大分子物质的出胞和入胞过程，从而介导信号分子的跨膜转运及运输，在多条信号通路中充当“枢纽”作用。

调节PASMCs表型转换的信号通路中，多个关键性的调节蛋白如人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)、过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR)调节蛋白等并未出现mRNA转录水平变化，但出现明显的核转移(跨核膜转移)，阻断这些蛋白的跨核膜转移能明显抑制PASMCs的增殖和迁移［18］，提示 ANNXⅠ/Ⅱ蛋白的跨膜转运、运输可能是调节PASMCs表型转换乃至细胞迁移、增殖的防治新靶点。目前，此方面的报道甚少，尚需进一步研究。

3.2 调控细胞骨架 细胞骨架不仅在维持细胞形态、承受外力、保持细胞内部结构的有序性方面起重要作用，而且还参与许多重要的生命过程。ANNXⅡ是顶端蛋白运输装置的重要成分，参与脂筏和肌动蛋白细胞骨架的调节［19］。ANNXⅡN端 Tyr-23磷酸化，促使ANNXⅡ/p11转位至细胞表面，通过启动Ras同源物(Ras homalogne，Rho)/Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶(Rho-associated coiled-coil protein kinase，ROCK)/LIM 激酶(LIM kinase，LIMK)/丝切蛋白(Cofilin)，诱导F-actin细胞骨架解聚，并牵引F-actin单体向细胞表层聚集，通过促进细胞膜局部突起、伸出伪足和管状形成，介导细胞分支形态发生，降低细胞间固有的稳定连接，导致细胞黏附丧失，参与细胞骨架调节蛋白Rho依赖的和肌动蛋白细胞骨架介导的细胞变形与迁移［20］。Babbin等［21］研究报道，敲除annexins A2后，检测Rho的膜结合与激活，随着annexins A2 siRNA转染，Rho从膜解离，并且活性降低。提示ANNXⅡ对Rho向质膜的转位发挥重要作用，ANNXⅡ通过靶向信号分子到膜结构域，发挥靶向Rho细胞膜转位的作用，从而调节 Rho相关信号转导，调控细胞骨架重组。ANNXⅡ与肌动蛋白在激活细胞骨架重建的区域共定位。ANNXⅡ与肌动蛋白的相互作用是Ca2+依赖的。ANNXⅡ通过定位于富含自由钩端和接近质膜的细胞质调节肌动蛋白聚合。ANNXⅡ可能通过单体的分离和钩端活性的封闭调节肌动蛋白纤维移动。许多细胞型的ANNXⅡ对于肌动蛋白肌丝动力学的调节，是一个有意义的参与者［22］。研究提供了关于ANNXⅡ功能的一个新观点，ANNXⅡ不仅为肌动蛋白依赖的微胞饮小体运动所需要，而且提示了一个更为广泛的作用，即ANNXⅡ在体内对肌动蛋白动力学具有调节作用。

肌动蛋白细胞骨架的动力学变化是导致血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)分化的主要细胞内信号之一。在早期表型转换中，肌动蛋白细胞骨架的重组能调节平滑肌细胞(smooth muscle cell，SMC)的2个关键转录因子血清应答因子(serum nesponse factor，SRF)和心肌蛋白的表达，以及CArG盒依赖启动子的活性。微丝抑制剂(latrunculm B，LatB)和(Jasplakinolide，Jasp)分别抑制VSMC和标记基因、SRF和心肌蛋白的增加。VSMC-特异基因的表达转录控制突出了CArG盒在SMC基因调控中的重要性。Zheng等［23］采用转染试验显示，Jasp有意义的增加CArG盒依赖SMC启动子的活性。因此，保证肌动蛋白细胞骨架的完整可能为血管疾病的进一步治疗提供潜在的治疗靶点。ANNXⅠ/Ⅱ通过对细胞骨架的调控，可能参与肝源性肺血管重塑的调节，具体机制有待研究证实。

3.3 参与膜形成 细胞膜和细胞器膜主要由脂质和蛋白质构成，含极少量的糖类物质。膜的形成既能维持稳定的细胞内环境，又能调节和选择物质进出细胞。ANNXⅠ在多囊泡的胞内体，控制细胞器膜的出芽和融合。ANNXⅠ二聚体或 ANNXⅠ/S100A11异四聚体与膜融合相关。膜囊泡从1个亚细胞定位到另1个细胞器的运输，需要许多蛋白质和特定排序、修饰及多个脂质的降解，某些脂质能使二维膜变形，促进管状形成和囊泡形成。多种蛋白质招募至这些位点以稳定和增加管状形成，并最终导致囊泡颈的关闭，胞内体重新合成，这与皮层下肌动蛋白细胞骨架的局部解聚和细胞内体重排的构象相关联［24］。Kang 等［25］研究发现，ANNXⅠ在饥饿法诱导的自噬降解过程中明显上调，提示ANNXⅠ在自噬的底物降解阶段具有重要作用。ANNXⅠ可能促进自噬内涵体的形成，进而促进自噬溶酶体的形成，降解其所含的内容物。自噬促进细胞蛋白和亚细胞细胞器的降解，对于功能异常的细胞器和错误折叠的蛋白质显示出重要的作用［26］，从而实现细胞稳态和细胞器更新。ANNXⅠ可能通过自噬的调节，影响质膜以及细胞器膜上的蛋白质降解，进一步影响膜形成。既往研究表明，ANNXⅡ和spireⅠ的成核及F-actin的稳定，为促进细胞内体膜重建所必需。对于早期细胞内体膜，ANNXⅡ在特定平台组织有助于成核、锚点和稳定肌动蛋白肌丝。肌动蛋白推动细胞内体运输中间体，推测ANNXⅡ有助于膜变形和成熟过程［27］。质膜损伤，ANNXⅠ/Ⅱ转位至质膜，发生一个Ca2+触发的融合反应，封闭损伤位点，提示ANNXⅠ/Ⅱ与质膜相互作用，促进膜分离、膜融合及在允许的空间限制内依赖钙敏感性的结合，对膜损伤作出等级反应。该过程有助于维持膜结构的完整［28］。

肝源性肺血管重塑，PAMSCs表型转换过程中涉及一系列细胞器水平的变化，在高分化型(收缩型)VSMC粗面内质网和高尔基体等细胞器减少，而低分化型(合成型)表现为肌纤维骤减，收缩功能消失，粗面内质网、核糖体和高尔基体等细胞器增多。细胞膜细胞器膜的形成和解聚消失可能参与这一过程的调控。ANNXⅠ/Ⅱ与细胞膜及细胞器膜的形成有关，可能参与肝源性肺血管重塑的调控，尚需进一步研究。

4 展 望

目前，在肝源性肺血管重塑研究中，信号通路的报道较多，而针对蛋白的研究甚少。蛋白质的跨膜转运、运输可能是调节PASMCs表型转换乃至细胞迁移、增殖的防治新靶点，较单一信号通路研究更有应用前景。ANNXⅠ/Ⅱ的膜聚集作用在PASMCs表型转换分子机制中可能起到“枢纽”作用。可以预料，随着对ANNXⅠ/Ⅱ研究的深入，其结构和膜聚集作用及在肝源性肺血管重塑中的作用会被逐渐阐明，这将为肝源性肺血管重塑的基因治疗探索一个更有价值的新靶点。

［1］国 斌，易 斌，徐顺贵，等.肝肺综合征大鼠血清对肺微血管内皮细胞Akt表达的影响［J］.中华麻醉学杂志，2010，30(1):75-78.

［2］国 斌，易 斌，鲁开智.哺乳动物雷帕霉素靶蛋白的研究进展［J］.医学研究生学报，2010，23(8):876-879.

［3］Morrell NW，Adnot S，Archer SL，et al.Cellular and molecular basis of pulmonary arterial hypertension［J］.J Am Coll Cardiol，2009，54(1):S20-S31.

［4］Monastyrskaya K，Babiychuk EB，Hostettler A，et al.Annexins as intracellular calcium sensors［J］.Cell Calcium，2007，41(3):207-219.

［5］陶晓倩，王大勇，柳海燕，等.膜联蛋白5对大鼠睾丸间质细胞睾酮分泌及3β-羟基类固醇脱氢酶表达的影响［J］.医学研究生学报，2010，23(4):342-346.

［6］Grewal T，Enrich C.Annexins-modulator of EGF receptor signaling and trafficking［J］.Cell Signal，2009，21(6):847-858.

［7］倪晓光，赵 平，王贵齐，等.膜联蛋白A1的结构和功能及其与恶性肿瘤的关系［J］.癌症进展，2010，8(1):63-66.

［8］Lim LHK，Pervaiz S.Annexin 1:The new face of an old molecule［J］.FASEB J，2007，21(7):968-975.

［9］章蔼然，潘 宁，侯颖春.膜联蛋白A2与恶性肿瘤进展的关系［J］.细胞生物学杂志，2008，30(3):307-311.

［10］Hu NJ，Bradshaw J，Lauter H，et al.Membrane-induced folding and structure of membrane-bound annexin A1 N-terminal peptides:implication for annexin-induced membrane aggregation［J］.Biophys J，2008，94(5):1773-1781.

［11］Illien F，Finet S，Lambert O，et al.Different molecular arrangements of tetrameric annexin 2 modulate the size and dynamics of membrane aggregation［J］.Biochim Biophysica Acta，2010，1798(9):1790-1796.

［12］Solito E，Christian HC，Festa M，et al.Post-translocational modification plays an essential role in the translocations of annexin A1 from the cytoplasm to the cell surface［J］.FASEB J，2006，20(7):E677-E857.

［13］Yan G，Luo W，Lu Z，et al.Epstein-Barr virus latent membrane protein 1 mediates phosphorylation and nuclear translocation of annexin A2 by activating PKC pathway［J］.Cell Signal，2007，19(2):341-348.

［14］Matsuda D，Nakayama Y，Horimoto S，et al.Involvement of Golgiassociated Lyn tyrosine kinase in the translocation of annexinⅡto the endoplasmic reticulum under oxidative stress［J］.Exp Cell Res，2006，312(7):1205-1217.

［15］Konoka-Postupolska D，Clark G，Hoffmann A.Structure，function and membrane interaction of plant annexins:An update［J］.Plant Sci，2011，181(3):230-241.

［16］Hayes MJ，Shao DM，Griere A，et al.Annexin A2 at the interface beween F-actin and membrane enriched in phosphatidylinositol 4，5-bisphosphate［J］.Biochim Biophys Acta-Mol Cell Res，2009，1793(6):1086-1095.

［17］Creutz CE，Edwardson JM.Organization and Synergistic binging of copine I and annexin A1 on supportde lipid bilayers observed by atomic force microscopy［J］.Biochim Biophys Acta，2009，1778(9):1950-1961.

［18］易 斌，钱桂生，白 莉，等.低氧致大鼠PASMC中PTEN/Akt1表达变化与细胞增殖［J］.中华结核与呼吸杂志，2008，31(8):586-590.

［19］Hein Z，Schmidt S，Zimmer KP，et al.The dual role of annexin Ⅱin targeting of brush border proteins and in intestinal cell polarity［J］.Differentiation，2011，81(4):243-252.

［20］Rescher U，Ludwig C，Konietzko V，et al.Tyrosine phosrylation of annexin A2 regulates Rho-mediated actin rearrangement and cell adhesion［J］.Cell Sci，2008，121(7):2177-2185.

［21］Babbin BA，Parkos CA，Mandell KJ，et al.Annexin 2 regulates intersinal epithelial cell spreading and wound closure through Rhorelated signaling［J］.Am J Pathol，2007，170(3):951-966.

［22］Hayes MJ，Shao D，Bailly M，et al.Regulation of actin dynamics by annexin 2［J］.EMBO J，2006，25(4):1816-1826.

［23］Zheng JP，Ju DH，Shen JB，et al.Disruption of actin cytoskeleton mediates loss of tensile stress induced early phenotypic modulation of vascular smooth muscle cells in organ culture［J］.Exp Mol Pathol，2010，88(1):52-57.

［24］Matteis MA，Luin A.Exiting the Golgi complex［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2008，9(4):273-284.

［25］Kang JH，Li M，Chen X，et al.Proteomics analysis of starved cells revealed Annexin A1 as an important regulator of autophagic degradation［J］.Biochem Biophys Res Communications，2011，407(3):581-586.

［26］Kirkin V，McEwan DG，Novak I，et al.A role for ubiquitin in selective autophagy［J］.Mol Cell，2009，34(3):259-269.

［27］Morel E，Parton RG，Gruenbery J.Annexin A2-dependent polymerization of actin mediates endosome biogenesis［J］.Dev Cell，2009，16(3):445-457.

［28］Draeger A，Monastyrskaya K，Babiychuk EB.Plasma membrane repair and cellular damage control:The annexin survival kit［J］.Biochem Pharmacol，2011，81(6):703-712.