唐氏综合征胎儿21号染色体上新微小RNA基因的鉴定和功能分析

李武县，徐 勇，2，刘雪燕，秦晓林，梁勤东，戴 勇，4，涂植光

（1.重庆医科大学教育部临床检验诊断学重点实验室，重庆400016；2.广东省深圳市坪山新区人民医院，广东 深圳518118；3.广东省深圳市人民医院急诊ICU，广东 深圳518020；4.广东省深圳市人民医院临床医学研究中心，广东 深圳518020）

唐氏综合征胎儿21号染色体上新微小RNA基因的鉴定和功能分析

李武县1，徐 勇1，2，刘雪燕3，秦晓林1，梁勤东1，戴 勇1，4，涂植光1

（1.重庆医科大学教育部临床检验诊断学重点实验室，重庆400016；2.广东省深圳市坪山新区人民医院，广东 深圳518118；3.广东省深圳市人民医院急诊ICU，广东 深圳518020；4.广东省深圳市人民医院临床医学研究中心，广东 深圳518020）

目的：利用Solexa高通量深度测序技术鉴定21号染色体上新的微小RNA （miRNA）基因，为阐明21号染色体功能、探索唐氏综合征 （DS）患者新的治疗靶点提供依据。方法：收集5例经染色体核型分析诊断为DS胎儿的脐带血和3例正常胎儿脐带血，分析染色体核型；提取胎儿脐带血单个核细胞总RNA，构建小RNA文库，采用Solexa高通量深度测序、计算机分析、Stem－loop RT－PCR法鉴定miRNA基因并分析其生物学功能。结果：血染色体核型分析，5例DS胎儿脐带血显示DS标准核型，3例正常胎儿脐带血显示正常核型；在DS胎儿脐带血中共发现21个新miRNA，其中仅1个候选miRNA来源于21号染色体，位于21号染色体的“DS关键区域”，命名为 “miR－nov21”，后者在DS胎儿脐带血单个核细胞中表达水平高于正常胎儿。生物学功能分析，miR－nov21可调节211个靶基因共215个位点，与基因的表达、细胞分化的调节、胚胎形态的发生和心脏的发育有关。结论：21号染色体 “DS关键区域”存在1个新的miRNA基因——miR－nov21。

微小RNA；唐氏综合征；高通量深度测序技术；脐带血

唐氏综合征 （Down syndrome，DS）又叫21－三体 （Trisomy 21，Ts21）综合征，因多出1条或部分21号染色体导致的一种出生缺陷型疾病，每700例婴儿中就有1例［1］。患者表现为先天性智力低下、精神迟钝、体格发育不全和先天性心脏缺陷等80多种临床症状［1］。近期生物学研究［2］发现：21号染色体上含有500多个基因，包括5个微小RNA （microRNA，miRNA） 基 因：miR－99a、let－7c、 miR－125b－2、 miR－155和miR－802。miRNA是一类小的、长度为19～25个核苷酸的内生性单链非编码调节RNA。可与靶基因mRNA的3′端特异性结合，使其降解或转录抑制，在细胞的增殖、分化、凋亡、胚胎的发育和组织分化等生物学过程中发挥非常重要的作用［3］。国内外直接或间接的研究［2，4－7］表明：21号染色体上5个 miRNA 的过表达与DS患者各种临床性状有关，如智力缺陷、儿童白血病、免疫缺陷和低血压等。为进一步研究21号染色体小RNA分子编码基因的功能，本研究首次使用Solexa高通量深度测序技术对21号染色体小RNA编码基因序列进行研究，探索新的miRNA基因。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2011年2月—2011年6月于广东省深圳市人民医院行产前诊断、经常规G显带染色体核型分析确诊为标准型DS胎儿的脐带血标本5例，正常胎儿脐带血3例。5例DS胎儿脐带血中，2例用于小RNA建库和测序分析，3例用于PCR验证。该研究由该院伦理委员会批准，且征得所有孕妇知情同意。

1.2 胎儿脐带血的采集和保存在超声引导下，抽取18～22孕周DS胎儿 （DS组）和正常胎儿（正常组）脐带血2～3mL于EDTA抗凝管中（BD公司），采用淋巴细胞分离液 （Invitrogen公司）提取脐带血单个核细胞，融入Trizol试剂（Invitrogen公司），置于冻存管中，冻存于－80℃保存备用。

1.3 脐带血RNA提取和Solexa测序 脐带血单个核细胞小RNA文库的建立与测序、生物信息学分析在华大基因研究院协助下完成，整个实验过程严格按照试剂和仪器操作说明书进行。主要实验流程：采用Invitrogen Trizol试剂盒抽提总RNA，再将2个样本等量混合，取10μg混合RNA样品用15%的变性聚丙烯胺凝胶电泳分离回收长度≤30核苷酸的小RNA；在T4RNA连接酶（Promega公司）作用下，在小RNA两端分别加上 5′ 端（5′－GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC－3′）和3′端 （5′－pUCGUAUGCCGUCUUCUGCUUGidT－3′） 接 头， 经 10% 的 triborate－EDTA（TBE）聚丙烯胺凝胶电泳纯化后，由Solexa小RNA反转录引物和PCR扩增后制成小RNA的cDNA文库。再用6%TBE聚丙烯胺凝胶电泳对cDNA文库进行纯化，用Illumina Hiq－2000测序仪进行测序分析。

1.4 数据处理和新miRNA的预测 首先对Solexa测序所得的小RNA分子序列进行去接头、去低质量和去污染等处理，得到18～30个核苷酸长度干净序列。然后用SOAP（2.0）软件将所得干净序列与人全基因组序列进行比对分析，将匹配上的序列按照 GenBank ＞ Rfam （10.0）＞miRBase17.0＞repeat＞exon＞intron的优先级顺序进行分类注释，对未比对上任何注释信息的序列用 “Unanno”表示。然后将Intron和Unanno的小RNA分子序列作为新miRNA预测的数据源，运用MIREAP和MiPred软件进行新miRNA的预测分析。

1.5 Stem－loop RT－PCR 验证 为验证 Solexa测序分析结果的可靠性和21号染色体上新miRNA基因在DS胎儿和正常胎儿中的表达变化，本研究运用SYBR Green Stem－loop RT－PCR对21号染色体上新miRNA的成熟体进行验证。运用Invitrogen Trizol试剂盒分别提取3例DS胎儿脐带血和3例正常胎儿脐带血单个核细胞的总RNA；在ABI－7500实时定量PCR仪上，采用20μL反应体系，运用miRNA分子特异性茎环逆转录引物（中国上海吉玛公司）和 M－MLV反转录试剂盒（Promega公司），经逆转录反应后，在95℃预变性5min，95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸32s的反应条件下连续扩增40个循环，每个基因设置3个复孔，cDNA浓度为1∶20，以rRNAU6为内参，采用2－△△Ct方法计算21号染色体上新miRNA基因的相对表达量。

1.6 新miRNA靶基因预测和靶基因生物学功能分析 为分析21号染色体上新miRNA的生物学功能，本研究首先用TargetScanHuman Custom（http：／／www.targetscan.org／vert ＿ 50／seedmatch.html）对新miRNA进行在线靶基因预测，然后运用 DAVID 的功能注释工具 （http：／／david.abcc.ncifcrf.gov／summary.jsp ） 对新miRNA的靶基因进行Gene Ontology生物学功能分析。

2 结 果

2.1 胎儿脐带血染色体核型分析 3例正常胎儿脐带血显示正常核型；5例DS胎儿脐带血经染色体核型分析，显示均为标准DS核型。见图1。

图1 5例DS胎儿和3例正常胎儿脐带血染色体核型分析结果Fig.1 The chromosome karyotyping results of cord blood in 5DS and 3normal fetusesA：Normal karyotypes；B：DS karyotypes.

2.2 小RNA分子序列分类注释 通过Solexa高通量深度测序技术对DS胎儿脐带血单个核细胞小RNA文库的测序分析，共得到23 324 424条10～30核苷酸长的高质量序列，经去接头、去低质量和去污染序列等处理后获得21 770 729条18～30核苷酸长的干净序列，占总量的90.6%，合计280 056种小RNA。运用SOAP （2.0）软件将所得各种小RNA与人全基因组序列 （hg19）进行比对 （最多允许2个碱基的错配），得到8 087 250条匹配序列，共58 523种小RNA分子。与公共数据库比对，将匹配上全基因组的小RNA序列分类注释为miRNA、tRNA、rRNA、细胞核小RNA 序列 （snRNA）、核仁小 RNA 序列（snoRNA）、piRNA、mRNA降解片段、重复序列（repeat）、细胞浆小RNA序列 （scRNA）、信号识别颗粒小 RNA 序列 （srpRNA）、内含子序列（Intron）和未注释序列 （Unanno），共12类。见表1。

2.3 新miRNA的预测及验证 通过MIREAP和MiPred软件的分析，本研究共发现21个新miRNA （表2）。主要来源于12条染色体，其中仅有1个新miRNA基因来源于21号染色体，位于21号染色体的 “DS关键区域”（chr21q22.2－q22.3）（图2，见插页三），本研究将该新miRNA基因命名为 miR－nov21。Stem－loop RT－PCR验证结果见表3。

表1 与全基因组序列匹配的小RNA分类注释表Tab.1 The annotation of small RNA species matching the complete genome sequence

表2 经MIREAP和MiPred筛出的21个新miRNA分子Tab.2 The 21new microRNAs verified by MIREAP and Mipred

表3 miR－nov21成熟体在3例DS胎儿和1例正常胎儿脐带血单个核细胞中的PCR验证结果Tab.3 The PCR results of mature miR－nov21in mononuclear cells of cord blood of 3DS and 1normal fetuses

2.4 靶基因预测和生物学功能分析 采用TargetScan Custom对 miR－nov21进行靶基因预测，得到211个靶基因共215个结合位点。Gene Ontology生物学功能分析，miR－nov21分子调控靶基因与基因的表达、细胞分化的调节、胚胎形态的发生和心脏的发育有关 （P＜0.001）。见表4。

表4 miR－nov21分子调控靶基因Gene Ontology生物学功能分析结果Tab.4 The Gene Ontology results of target genes of miR－nov21

3 讨 论

本研究通过Solexa高通量深度测序技术和新miRNA预测软件 MiPred以及Stem－loop RT－PCR的验证发现：在21号染色体 “DS关键区域”存在1个新的miRNA分子基因 （miR－nov21）。其前体发夹结构序列长度为83个核苷酸，最小折叠自由能为－32.00kal·mol－1（＜－18kal·mol－1）。miR－nov21成熟体长度为23个核苷酸，位于前体发夹结构的茎臂上。用UCSC基因分析平台对miR－nov21进一步分析结果显示：miR－nov21基因位于β－淀粉样前体蛋白剪切酶2 （beta－site APP cleaving enzyme 2，BACE2）基因第9个内含子的反义链上，提示miR－nov21基因的表达与BACE2基因有关。BACE2蛋白酶可诱导淀粉样蛋白的生成，造成淀粉样蛋白的累积使神经变性，在阿尔茨海默病和DS患者痴呆的形成过程中具有重要作用［8］。

研究［9］认为：多出的21号染色体上基因表达不平衡是导致DS各种表型的根本原因，而位于21号染色体 “DS关键区域”内基因的表达变化，则在DS患者各种临床症状的形成过程中发挥重要作用。Stem－loop RT－PCR 结果显示：miR－nov21在DS胎儿脐带血单个核细胞中高表达，是对照组的1.5倍，说明miR－nov21与21号染色体上已知的5个miRNA相同，在DS疾病的形成过程中可能具有重要的作用。靶基因分析结果显示：miR－nov21可调节CpG－岛甲基化结合蛋白2（methyl－CpG－binding protein 2，MeCP2）的表达。MeCP2蛋白是一种转录因子，在大部分组织和细胞中均有表达，尤其在脑组织中表达量最高［10］；可与CpG－岛甲基化二核苷酸结合，诱导组蛋白修饰和染色质重塑相关蛋白复合体的富集，调节特定靶基因的表达，对神经元的发育具有重要作用［10］。值得注意的是，MeCP2也是21号染色体上miR－155、miR－802、let－7c和 miR－125b－2的靶基因，与 miR－155、miR－802、let－7c和 miR－125b－2的表达成负相关关系。Kuhn等［2，11］研究发现：MECP2蛋白在DS胎儿脑组织中低表达，对DS患者的智力发育具有重要影响。这在DS小鼠模型的脑部海马组织实验中得到证实［7］，提示21号染色体上miRNA的过表达与DS患者先天智力缺陷有关。

miR－nov21靶基因的生物学功能分析显示：miR－nov21与基因的表达、细胞分化的调节、胚胎形态的发生和心脏的发育有关。在细胞分化的调节上，miR－nov21可通过与其靶基因3′端特异性结合，调节其靶基因 SMAP1、ETS1、CDK6、FOXO3、PURB和TOB2的表达，参与调控红细胞和粒细胞的分化。由于miRNA与其靶基因的表达呈负向调控关系，提示在本研究中miR－nov21的高表达理论上可使其靶基因SMAP1、ETS1、CDK6、FOXO3、PURB和TOB2的表达降低，进而导致红细胞和粒细胞的分化成熟障碍，参与DS新生婴儿 “暂时性白血病”以及后期DS患者白血病的形成［12］。此外，生物信息学分析结果显示：miR－nov21 可 通 过 调 控 BBS4、BMP2、XIRP1、NODAL、 RXRA、 GATA 4、 ADIPOR2、 PTCH1、SOX6和GJC1基因的表达，参与心脏发育的调节。研究［13－14］表明：NODAL信号通路与心脏的不对称发育有关；GATA4基因的缺失可导致心脏分叉和胚胎死亡，其在心脏发育早期失活则可导致心肌发育不良和心内膜垫缺损，而在晚期失活可导致心脏功能的下降。因此，miR－nov21的高表达可能与DS胎儿心脏先天性缺陷的形成有关。

综上所述，位于21号染色体 “DS关键区域”内的miR－nov21基因与DS疾病的发生和发展有密切关联。但由于临床收集样本较困难，无法对miR－nov21的功能作进一步的临床验证。虽然如此，该新miRNA在本研究中的发现为进一步研究21号染色体的功能、探索DS患者新的治疗靶点提供了实验依据。

［1］Sommer CA， Henrique－Silva F. Trisomy 21and Down syndrome：a short review ［J］.Braz J Biol，2008，68 （2）：447－452.

［2］Kuhn DE，Nuovo GJ，Terry AV，et al.Chromosome 21－derived microRNAs provide an etiological basis for aberrant protein expression in human Down syndrome brains ［J］.J Biol Chem，2010，285 （2）：1529－1543.

［3］Bartel DP.MicroRNAs：genomics，biogenesis，mechanism，and function［J］.Cell，2004，116 （2）：281－297.

［4］Elton TS，Sansom SE， Martin MM. Trisomy－21gene dosage over－expression of miRNAs results in the haploinsufficiency of specific target proteins［J］.RNA Biol，2010，7 （5）：540－547.

［5］Sethupathy P，Borel C， Gagnebin M，et al. Human microRNA－155on chromosome 21differentially interacts with its polymorphic target in the AGTR1 3′untranslated region：a mechanism for functional single－nucleotide polymorphisms related to phenotypes ［J］.Am J Hum Genet，2007，81 （2）：405－413.

［6］Zhang YJ，He XJ，Liu YJ，et al.Abnormal expression of microRNAs in the hippocampus of Ts65Dn mice［J］.Beijing Da Xue Xue Bao，2010，42 （2）：173－178.

［7］Keck－Wherley J， Grover D， Bhattacharyya S，et al.Abnormal microRNA expression in Ts65Dn hippocampus and whole blood：contributions to down syndrome phenotypes［J］.Dev Neurosci，2011，33 （2）：451－467.

［8］Cheon MS，Dierssen M，Kim SH，et al.Protein expression of BACE1，BACE2and APP in Down syndrome brains［J］.Amino Acids，2008，35 （2）：339－343.

［9］Patterson D. Molecular genetic analysis of Down syndrome［J］.Hum Genet，2009，126 （1）：195－214.

［10］Kaufmann WE，Johnston MV，Blue ME.MeCP2expression and function during brain development：implications for Rett syndrome’s pathogenesis and clinical evolution ［J］.Brain Dev，2005，27（Suppl 1）：S77－S87.

［11］Kuhn DE， Nuovo GJ， Martin MM，et al. Human chromosome 21－derived miRNAs are overexpressed in down syndrome brains and hearts ［J］.Biochem Biophys Res Commun，2008，370 （3）：473－477.

［12］Choi JK.Hematopoietic disorders in Down syndrome［J］.Int J Clin Exp Pathol，2008，1 （5）：387－395.

［13］Roessler E，Pei W，Ouspenskaia MV，et al.Cumulative ligand activity of NODAL mutations and modifiers are linked to human heart defects and holoprosencephaly［J］.Mol Genet Metab，2009，98 （1／2）：225－234.

［14］Zeisberg EM，Ma Q，Juraszek AL，et al.Morphogenesis of the right ventricle requires myocardial expression of Gata4［J］.J Clin Invest，2005，115 （6）：1522－1531.

Identification and functional analysis of chromosome 21－derived new microRNA gene in Down syndrome fetuses

LI Wu－xian1，XU Yong1，2，LIU Xue－yan3，QIN Xiao－lin1，LING Qin－dong1，DAI Yong1，4，TU Zhi－guang1
（1.Key Laboratory of Clinical Medical Diagnostics，Ministry of Education，Chongqiong Medical University，Chongqing 400016，China；2.Pingshan People’s Hospital，Guangdong Province，Shenzhen 518118，China；3.Emergency Intensive Care Unit，Shenzhen People’s Hospital，Guangcdong Province，Shenzhen 518020，China；4.Clinical Medical Research Center，Shenzhen People’s Hospital，Guangdong Province，Shenzhen 518020，China）

ObjectiveTo identify the novel microRNA （miRNA）gene located at the chromosome 21by Solexa high－throughput sequencing technology，and to provide basis for clarifying function of the chromosome 21and investingating the new therapeutic target of Down syndrome （DS）patients.MethodsThe cord blood of 5DS fetues verified by chromosome karyotype analysis and 3normal fetuses were collected.Total RNA was extracted from mononuclear cells of cord blood in DS fetuses to construct the small RNA library.Then the miRNA gene was identified by Solexa high－throughput sequencing，computer analysis and Stem－loop RT－PCR，and its biological function was analyzed.ResultsThe chromosome karyotype analysis showed that the karyetypes in cord blood of DS fetuses were standard DS karyotypes，and those in normal fetuses were normal karyotypes.A total of 21novel miRNAs were identified in cord blood of DS fetuses.But only one candidate miRNA was located on the“DS critical region”of the chromosome 21，named as“miR－nov21”，and its expression level in mononuclear cells of cord bood in DS fetuses was higher than that in normal fetuses.Biological funcation analysis revealed that miR－nov21could regulate 211conserved target genes containing 215conserved sites，which were involved in gene expression，regulation of cell differentiation，embryonic morphogenesis，and heart development.ConclusionThere is a novel miRNA gene in“DS critical region”of the chromosome 21.

microRNA；Down syndrome；high－throughput sequence technology；cord blood

R596

A

1671－587Ⅹ（2012）06－1141－06

2012－02－06

广东省科技厅科技计划项目资助课题 （2012B032000008）；深圳市重点科技计划资助课题 （201001006）

李武县 （1985－），男，重庆市人，在读医学硕士，主要从事分子遗传学与生物化学方面的研究。

涂植光 （Tel：023－68485797，E－mail：tuzhiguang＠yahoo.com.cn）