2例EV71死亡病例的病理特征及EV71宁波分离株全基因组序列分析

方仲年 胡爱荣 张岳灿 顾文珍 蒋素文 胡耀仁 陆传统 朱德东

手足口病(hand，foot and mouth disease，HFMD)是一种主要由柯萨奇病毒A16(coxsakie virus A16，CV Al6)和肠道病毒71(enterovirus71，EV71)等引发的传染病，临床上以发热和手、足、口部出现皮疹、疱疹等为主要特征。该病是一种自限性疾病，绝大多数病例1周内可以痊愈，但少数患者可并发无菌性脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹、呼吸道感染和心肌炎等，如不及时治疗，可能致命［1］。为了加强对本病的重视和认识，现将2例HFMD死亡患儿的临床特点、尸体解剖结果及病原学检测结果报告如下。

资料与方法

1．临床资料:(1)病例1:男患儿，15个月，本地户籍。发热2天，流涎、手部皮疹1天。患儿于2010年7月16日出现发热(体温最高39℃)，食欲不振，无咳嗽。在当地医院予以输液治疗(具体用药不详)，第2天体温恢复至正常。继而出现流涎，左手指间出现小水疱疹，夜间有哭闹。晨起烦躁不安，恶心、呕吐4次。于2010年7月17日下午2时来宁波市第二医院就诊。查体:神志清楚，精神疲软，上唇内侧黏膜处1处溃疡，颈项不抵抗，心肺听诊无异常，生理反射存在，病理反射无异常，左手指间有小水疱疹。查血常规:WBC 9．5×109/L，中性粒细胞 66．4%，淋巴细胞 23．5%，RBC 3．61 ×1012/L，Hb 96g/L，PLT 113×109/L。门诊建议住院治疗，但是患儿家属拒绝住院。门诊医生予以“清开灵颗粒、抗病毒口服液、康复新液以及头孢克肟”治疗。患儿于2010年7月17日夜间8时许病情恶化，出现呼吸困难，急送当地医院，但患儿已经死亡。(2)病例2:男患儿，14个月，外来人口(贵州籍)。发热，头颈部及躯干红色皮疹2天。发热体温最高39．1℃，无咳嗽、恶心、呕吐及腹泻。于2010年5月6～9日在当地医院门诊就诊。临床怀疑为“手足口病”，并在门诊输液治疗(具体用药不详)，未在医院留观。于2010年5月10日下午4时30分患儿突然无心跳、呼吸，急送上级医院，但患儿已经死亡。

2．尸体解剖及组织病理学:患儿均于第2天下午依法在宁波天一职业技术学院尸检室进行尸体解剖，尸检标本经中性甲醛固定，石蜡包埋，4μm厚切片，HE染色，进行常规组织病理学观察。并取患儿肠内容物及肠道组织送宁波市疾病预防控制中心(CDC)进行病毒检测，经real－time PCR检测均为EV71感染。

3．EV71的提取与扩增:患儿肠道内容物经超声破碎离心后，应用Qiagen试剂盒(美国)提取病毒RNA，随后进行反转录扩增得到cDNA(一步法RT－PCR试剂盒，日本TaKaRa公司，严格按照说明书操作)，扩增引物及片段长度见表1。反应条件为 94℃ 4min，随后94℃ 45s，58℃ 45s，72℃ 2min，共计34个循环，72℃ 10min。3'末端快速扩增(3'RACE)及5'末端快速扩增(5'RACE)采用日本TaKaRa公司5'－and 3'－Full RACE试剂盒，严格按照说明书操作，扩增引物及片段长度见表1。反应条件为 94℃ 3min，随后 94℃ 45s，55℃ 45s，72℃1min，共计25个循环，72℃ 10min。PCR产物1%琼脂糖凝胶上样孔，另设空白对照和DNA标志物，直流80V电泳45min，紫外检测仪下观察结果并用凝胶成像系统保存。

表1 PCR引物、位置及目的片段

4．分子克隆、测序及同源性比较:PCR产物的纯化DNA回收后，制备感受态细胞，将PCR产物连接入pMD18－T载体，按照载体说明书进行操作，挑选克隆经过酶切鉴定后，终止法测定插入片段的核苷酸序列。采用DNAMAN软件和Blast software(http://blast．ncbi．nlm．nih．gov/)对系列进行拼接和比对。

结 果

1．大体解剖所见:2例患儿均发育营养良好。手部有小泡疹，口腔黏膜小溃疡，角膜混浊。额部、下颌、上颈、肩胛、上胸部及会阴、臀部均可见粉红色丘疹，上唇及下唇均见口腔溃疡。体表淋巴结未肿大。口唇、指甲发绀。气管内见泡沫状物质;气胸试验阴性，胸腔内无明显渗出液，两肺组织体积增大，显著暗红色，质地实，放入水中下沉;肺外膜、纵隔见少量出血点。心脏外观正常，心包腔内少量淡黄色液体渗出。腹腔内无渗出液，肠系膜充血，部分空肠及回肠坏死呈灰褐色，肠系膜淋巴结肿大;腹腔其余器官未见明显异常。颅腔内无出血，颅内少量淡红色液体，脑膜充血，脑水肿显著。

2．心脏镜下所见:2例患儿心肌纤维细胞结构正常，心肌间质充血，心肌细胞水肿，心外膜少量炎性细胞浸润。心脏结构正常(图1)。

图1 心肌细胞水肿(HE，×200)

3．肺脏镜下所见:2例患儿两肺显著充血，肺泡壁毛细血管和肺小静脉高度扩张淤血，肺泡腔内充满水肿液，部分区域肺出血，使肺组织显著实变，肺间质及小血管周围见少量炎细胞浸润，以淋巴细胞为主(图2、图3)。病例2除上述表现外，两肺散在区域性炎性细胞浸润，以中性粒细胞及淋巴细胞为主。

4．肠道镜下所见:2例患儿肠黏膜充血，肠黏膜下淋巴滤泡增生，空肠及回肠部分区域肠黏膜、黏膜下层、平滑肌层、浆膜均坏死，细胞核消失，胞质及间质溶解，肠壁变得菲薄。肠系膜淋巴结肿大，淋巴滤泡反应性增生，生发中心坏死(图4、图5)。

5．大脑镜下所见:2例患儿大脑膜血管高度扩张充血，间质水肿，软脑膜及蛛网膜下腔炎性细胞浸润，以淋巴细胞、巨噬细胞为主，病变累及大脑、颅底、小脑、脊髓等脑脊膜。脊髓、延脑、脑桥等脑干部位的实质血管扩张、充血，血管间隙增宽，淋巴细胞、巨噬细胞等炎性细胞围绕血管壁周围浸润，脑实质散在片状坏死，中性粒细胞浸润，软化灶形成(图6～图8)。

图6 脑膜炎(脑膜炎性细胞浸润)(HE，×200)

6．其他脏器镜下所见:2例患儿肝血窦及中央静脉淤血，肝细胞高度水肿，肝小叶结构正常;肾间质充血，肾小管上皮细胞水肿，肾近曲小管上皮细胞自溶;肾上腺髓质充血;脾窦显著淤血;胰腺组织结构及胰腺细胞未见明显异常;胸腺结构正常，胸腺细胞增生，胸腺间质充血。

7．病原学检测:肠内容物及总肠道组织病毒检测(PCR)均为EV 71阳性(Ct值分别为19及17)。EV 71宁波分离株的全基因长度为7414个碱基，为C4亚型，命名为NBChina01，在GenBank的注册登记号为 HQ828086。通过 ncbi nucleotide blast(http://blast．ncbi．nlm．nih．gov/)系统并与 GeneBank 中EV71其他的序列(EU812515．1)进行比较，同源性为98%［2］。

讨 论

此2例患儿年龄均＜3岁，以发热开始，但体温恢复快，外周血白细胞计数增高不明显，导致临床医师及患儿家属轻视;然而该患儿精神较疲软，夜间有哭闹，烦躁不安，伴恶心、呕吐。符合《手足口病诊疗指南(2010年版)》重症病例早期识别的标准［3］。

EV71感染主要病理改变在中枢神经系统、肺以及肠道。以显著脑水肿为主要大体改变。文献报道EV71感染的中枢神经系统病变以病毒性脑干脑炎为主要病理学特点，表现为以淋巴单核细胞为主的炎性细胞围绕脑血管形成血管轴套、神经元坏死及软化灶形成、小胶质细胞增生并吞噬神经元、形成胶质结节等［4］。但该患儿除上述表现外，脑膜炎亦比较突出，软脑膜及蛛网膜下腔炎性细胞浸润，以淋巴细胞、巨噬细胞为主，病变累及大脑、颅底、小脑、脊髓等脑脊膜。因此，EV71重症感染患者的中枢神经系统病变应包括脑膜炎及脑炎。

肺脏亦是明显受损的器官，两肺充血及出血显著，伴有肺间质及小血管周围炎细胞浸润，与文献报道一致［5］。众多研究也证明EV71引起的肺部的病变是神经源性的而非由病毒直接侵犯造成的，可能是基于肺组织病毒学检测阴性，无弥漫性肺损伤及炎性浸润的原因［6～8］。但本患儿肺间质及小血管周围均见以淋巴细胞为主的炎细胞浸润，是否能作为病毒侵犯的间接依据?遗憾的是，本研究未对患儿的肺组织进行病毒学检测。

关于EV71重症患者肠道改变的报道较少。本患儿的肠道病变显著，且肠内容物及总肠道组织EV71病毒核酸检测均为阳性，与韦丹及杨郁等［5，8］报道不一致。因此，对于重症HFMD患儿，除密切关注神经系统、呼吸系统及循环系统表现外，肠道功能的保护亦不容忽视。

目前关于HFMD导致循环系统损害的机制观点尚不一致，有认为是心肌损害或心肌炎所致;也有观点认为其表现为神经源性，是脑干脑炎引起的中枢性交感兴奋所致，而非心源性［9］。依据本患儿的病理改变，作者认为以神经源性损害为主，同时存在心肌损害及心包膜炎症。患儿其他脏器亦有不同程度的损害及改变，但其器官组织的结构基本正常，考虑为重症病例组织器官充血、淤血引起的继发性改变。

根据VP1区核苷酸序列，可将EV 71分为A、B、C 3个基因型，其中B型和C型又进一步分为B1～B5和C1～C5亚型，EV71宁波分离株为C4亚型，与其他的报道一致［3，10］。有研究认为，感染某些基因亚型EV71是导致重症HFMD的因素之一，而中国内地HFMD 重症患儿主要为 C4 亚型 EV7l感染［3，11］。笔者认为，HFMD患儿严重的肠道损害可能与C4亚型EV71感染相关。

总之，EV71感染的HFMD病情进展快，中枢神经系统、肺脏以及肠道为主要受损脏器，严重的脑膜炎、脑干脑炎和神经源性肺水肿、肺出血是死亡主要原因，除密切关注神经系统、呼吸系统及循环系统表现外，肠道功能的保护亦需要重视。2011年4～5月全国共上报HFMD病例330279例，死亡116例，发病率和病死率均居丙类传染病的首位［12，13］。因此，临床医生特别是门急诊医生应该高度重视HFMD患儿的早期诊断和治疗，尤其是那些症状不典型的婴幼儿;同时，积极开展对EV71的全基因序列分析研究，可为阐明EV71的起源、致病机制及疫苗的研制提供线索。

1 慎强，胡爱荣，施凯舜，等．重症手足口病危险因素及临床特点分析［J］．医学研究杂志，2011，40(2):93 －95

2 Wang LC，Tang S Q，Li YM，et al．A comparison of the biological characteristics of EV71 C4 subtypes from different epidemic strains［J］．Virol Sin，2010，25(2):98 －106

3 中华人民共和国卫生部．手足口病诊疗指南(2010年版)［J］．国际呼吸杂志，2010，30(24):1473－1475

4 Hsueh C，Jung SM，Shih SR，et al．Acute encephalomyelitis during an outbreak of enterovirus type71 infection in Taiwan:report of an autopsy case with pathologic，immunofluorescence，and molecular studies［J］．Mod Pathol，2000，13(11):1200 －1205

5 韦丹，李坤雄，陈娥．肠道病毒71型脑干脑炎二例尸检报道及文献复习［J］．中华儿科杂志，2010，48(3):220－223

6 Prager P，Nolan M，Andrews IP，et al．Neurogenic pulmonary edema in enterovirus 71 encephalitis is not uniformly fatal but causes severe morbidity in survivors［J］．Pediatr Crit Care Med，2003，4(3):377 －381

7 Kao SJ，Yang FL，Hsu YH，et al．Mechanism of fulminant pulmonary edema caused by enterovirus 71［J］．Clin Infect Dis，2004，38(12):1784－1788

8 杨郁，王华，杜鹃，等．感染肠道病毒71型尸检病例的分子病原学诊断［J］．中华病理学杂志，2009，38(4):258－262

9 马沛然，王伟．手足口病并发心肌炎的诊治［J］．山东医药，2008，48(17):112

10 Brown BA，Oberste MS，Alexander JP Jr，et al．Molecular epidemiology and evolution of enterovirus 71 strains isolated from 1970 to 1998［J］．J Virol，1999，73(12):9969 －9975

11 Ooi MH，Wong SC，Podin Y，et al．Human enterovirus71 disease in Sarawak，Malaysia:a prospective clinical，virological，and molecular epidemiological study［J］．Clin Infect Dis，2007，44(5):646 －656

12 中国疾病预防控制中心公共卫生监测和信息服务中心．2011年4月中国甲乙丙类传染病疫情动态简介［J］．疾病监测，2011，26(4):337

13 中国疾病预防控制中心公共卫生监测和信息服务中心．2011年5月中国甲乙丙类传染病疫情动态简介［J］．疾病监测，2011，26(5):421