核黄素四丁酸酯抗焦虑作用的药效学研究

于文潇，赵 德，邓 君

(1.西南大学药学院，重庆 400716;2.北大国际医院集团重庆大新药业股份有限公司，重庆 400700)

焦虑症是一种常见的精神类疾病，随着社会压力的日趋激烈，其发病率逐年升高［1］。目前临床常用的抗焦虑和抗抑郁药物有诸多不良反应，如:头昏、停药后复发、认知障碍、药物依赖等［2］，因此研发疗效好、针对性强、副作用少的抗焦虑和抗抑郁药物成为近年的研究热点［3］。

有报道称维生素等营养物质的匮乏可能导致焦虑抑郁等精神疾病，因此在相应的药物治疗中添加维生素(尤其是复合维生素B族)，可达到更佳的治疗效果［4］。研究表明，维生素 B2对产后抑郁症有一定疗效［5］，维生素B2还可加强三环类抗抑郁药治疗伴有认知功能障碍的老年抑郁症［6］。

核黄素四丁酸酯(RTB)是维生素B2的衍生物，一直被用作降血脂药物(维脉宁)，具有抑制血小板聚集和增加纤维蛋白溶解活性的作用，用于高血脂、冠心病和血栓性疾病的治疗［7］。RTB对精神疾病的药理活性尚未见报道，本文采用行为药理学的实验方法初步考察RTB的抗焦虑药理作用。

1 材料

1.1 实验动物 SPF级昆明种小鼠，♂，8周龄，体重18～24 g，购买于第三军医大学实验动物中心。自由摄食饮水。光照节律12L:12D(7:00～19:00)，室温(25±2)℃。环境安静。每只动物只用1次。

1.2 药物与试剂 ① RTB:由重庆大新药业股份有限公司提供;临用前用0.5%的羧甲基纤维素钠溶液混悬均匀，避光保存。②地西泮静脉注射液:SWJ®，湖北制药有限公司，批号09070001;用0.5%的羧甲基纤维素钠溶液稀释成所需浓度，新鲜配制，4℃保存。③ 盐酸丁螺环酮片，江苏恩华药业股份有限公司，生产批号:20100202。配制方法同上。④羧甲基纤维素钠:成都科龙化工试剂厂，批号:20090402。

1.3 主要仪器 高架十字迷宫(elevated plusmaze，EPM):两个开臂(长30 cm，宽5 cm)与两个闭臂(长30 cm，宽5 cm，高15 cm)相互垂直，中央平台5 cm×5 cm。迷宫距离地面50 cm。PM-200十字迷宫跟踪分析系统，成都泰盟科技有限责任公司。YLS-4C型转棒式疲劳仪，山东省医学科学院设备站。

2 方法

2.1 动物分组 动物适应饲养3 d，按体重随机分为RTB高、中、低剂量组、地西泮组、丁螺环酮组和空白组。EPM实验和新型食物消耗实验，每组动物15只;转棒实验，每组动物10只。

2.2 给药方式 一次性灌胃给药。按照人与动物的体表面积计算法换算出RTB高、中、低剂量组分别为 80、40、20 mg·kg－1，约相当于人给药剂量 10、5、2.5 mg·kg－1;地西泮按 2 mg·kg－1给药，丁螺环酮按5 mg·kg－1给药;空白组灌服等容积的0.5%羧甲基纤维素钠溶液。RTB组、丁螺环酮组和空白组给药1 h后，地西泮组给药0.5 h后，进行行为学测试，测试时间为9:00～15:30。

2.3 小鼠高架十字迷宫实验［8］所有动物提前2 h进入测试实验室。测试前将每只小鼠放入1个60 cm×60 cm×35 cm塑料盒中，自由探究5 min，然后迅速置于EPM的中央平台，头朝一开臂，放开，由跟踪分析系统自动记录5 min内小鼠分别进入开臂的次数(open arm entry，OE，以小鼠4只爪子均进入到臂内为准)和进入闭臂的次数(close arm entry，CE，同上)以及分别在开臂内的滞留时间(open arm time，OT，单位:s)和在闭臂内的滞留时间(close arm time，CT，单位:s)，计算出:① 进入开臂和闭臂的总次数(OE+CE)，作为小鼠运动活力(locomotor activity)的评价指标;② 开臂进入次数百分比(OE%)，即OE/(OE+CE)×100%;③ 开臂滞留时间百分比(OT%)，即 OT/(OT+CT)×100%［9］;OE%和OT%作为抗焦虑作用的指标。每只小鼠测试完毕后用酒精擦拭迷宫，排除气味对下只小鼠的干扰。

2.4 小鼠新型食物消耗实验(novel food consumption test)［10］实验前所有小鼠禁食16 h。给药一定时间后，每只小鼠置于一干燥洁净的塑料盒(24 cm×10 cm×8 cm)中。每个盒中同一位置放入一直径9 cm的表面皿，内盛定量新型食物(鼠料粉∶色拉油=2∶1)。记录每只小鼠5 min内的食物消耗量，计算小鼠每克体重消耗食物的量，以mg·g－1表示。

2.5 转棒实验(rota-rod test)［11］实验前1 d训练所有实验动物，能在转杆上停留5 min的动物进入第2天的测试，排除不达标者。实验时将小鼠放于直径7 cm的转杆上，转速为10 r·min－1。分别在给药1 h、3 h、6 h和24 h后将小鼠置于转杆上，记录各组小鼠在1 min内的跌落只数，计算成功率(成功率/%=未跌落小鼠数/每组小鼠总数×100%)。

3 结果

3.1 小鼠高架十字迷宫实验 EPM实验结果(Tab 1)表明，与空白对照组比较，各给药组的总入臂次数(OE+CE)没有明显变化，提示各组药物均未改变动物的活动能力。地西泮和丁螺环酮组均明显地增加小鼠OE%和OT%值。RTB各剂量组的OE%和OT%值均较空白组增加，且20和40 mg·kg－1组与空白组比较差异有显著性，说明低剂量和中剂量RTB在EPM模型上显示出抗焦虑作用。

Tab 1 Effect of RTB on the behavior of mice in EPM(± s，n=15)

Tab 1 Effect of RTB on the behavior of mice in EPM(± s，n=15)

DZP:diazepam;RTB:riboflavin tetrabutyrate;*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control

Group Dose/mg·kg－1OE+CE OE% OT%Control － 12.06±8.05 34.42 ±17.24 34.77±18.90 DZP 2 15.26±11.02 50.50 ±15.83＊＊ 59.11±20.65＊＊Buspirone 5 11.00±6.96 48.07 ±19.96* 49.47±22.20 RTB 20 13.40±4.87 46.71 ±16.15* 49.62±17.51*40 13.53±4.32 49.60 ±16.44* 50.18±18.53*80 12.86±8.01 42.26 ±12.88 41.00±11.56

3.2 小鼠新型食物消耗实验 结果(Tab 2)显示，地西泮能增加小鼠在新奇环境中对新型食物的消耗量，但丁螺环酮对小鼠新型食物消耗量的增加未达到统计学意义。RTB各剂量组小鼠单位体重的食物消耗量均较空白组增加，且40和80 mg·kg－1组与空白组比较差异有显著性(P＜0.05)，即在小鼠新型食物消耗实验中，RTB在中剂量和高剂量时表现出抗焦虑作用。

3.3 小鼠转棒实验 结果(Tab3)显示，与空白组比较，地西泮和丁螺环酮导致小鼠从转棒上的跌落率增加，提示地西泮和丁螺环酮对受试动物的运动协调性有损伤。而RTB各组小鼠的跌落率没有明显变化，说明RTB在所给剂量下单次给药，对小鼠的肌肉协调能力没有明显损害作用。

Group Dose/mg·kg－1 Consumption of novel food/mg·kg －1 Control － 6.78 ±2.73 DZP 2 10.42 ±4.30＊＊Buspirone 5 8.55 ±2.89 RTB 20 8.26 ±4.48 40 10.20 ±2.94*80 9.93 ±4.11*

DZP:diazepam;RTB:riboflavin tetrabutyrate;*P＜0.05，＊＊P＜0.01vscontrol

Tab 3 Effect of RTB on the rate of falling from rota-rod of the mice(n=10)

4 讨论

EPM为国际公认的测试动物焦虑行为的首选模型，它利用动物对新奇环境的探究习性与对高悬敞开臂的恐惧，形成动物的矛盾冲突心理，通过动物的行为表现考察动物的焦虑情绪［12］。OE%和OT%反映了动物趋近－规避冲突的结果，与焦虑程度直接相关，抗焦虑药物可以使OE%和OT%增高;而开臂和闭臂的总进入次数反映了动物的活动能力。新型食物消耗实验也是筛选抗焦虑药物的经典行为药理学模型，利用动物在新奇环境中的逃避心理和对诱人食物的享用欲望形成矛盾冲突，使动物产生焦虑情绪。抗焦虑作用的药物可以翻转陌生环境对摄食行为的抑制，缩短动物对新型食物消耗的潜伏期及增加对食物的消耗量［13］。

EPM实验中，RTB各剂量组小鼠的活动能力无明显改变，但OE%和OT%均较空白组增加，且20和40 mg·kg－1剂量组差异有显著性，但作用不如地西泮。新型食物消耗实验中，RTB 40和80 mg·kg－1剂量能明显增加动物单位体重的食物消耗量。上述结果均表明，RTB具有抗焦虑作用，且在40 mg·kg－1剂量下抗焦虑效果最优。

上述实验结果中，苯二氮卓类抗焦虑药物地西泮的抗焦虑效果最优，但转棒实验中其对动物的肌肉协调能力损害最大;5-HT1A受体激动剂的代表药物丁螺环酮的抗焦虑效果不如地西泮，可能因为其作用效果缓慢且需要多次用药［14］，而本研究中采用单次给药且用药时间短，导致其未完全发挥出抗焦虑作用。RTB虽然抗焦虑作用不及地西泮，但对受试动物的肌肉协调能力无明显损伤，且该药物在降血脂应用中未表现出明显毒副作用，有望成为一种安全的新型抗焦虑药物。

RTB的抗焦虑机制可能是通过其前体化合物核黄素(维生素B2，Vit B2)起作用。Vit B2是黄素蛋白的辅酶FMN和FAD的核心组成成分，是重要的电子传递体，参与细胞呼吸过程，且为其他多种细胞过程所需［15］。Vit B2还影响其他维生素的作用，如Vit B6转化为其活性形式磷酸吡哆醛就必需Vit B2的参与。而磷酸吡哆醛是多种神经递质体内合成关键酶的辅酶，如催化色氨酸合成5-羟色胺(5-HT)的色氨酸脱羧酶、催化谷氨酸盐转化为γ-氨基丁酸(γ-GABA)的L-谷氨酸脱羧酶等均以磷酸吡哆醛为辅酶［16］，故 Vit B2对于维持抑制性神经递质——5-HT、GABA的正常水平是必需的。此外，兴奋性神经递质去甲肾上腺素(NA)的代谢失活需要单胺氧化酶(MAO)，而MAO是黄素蛋白酶，其催化活性需要Vit B2的直接作用［17］。所以，Vit B2是神经系统发挥正常功能的保证，其缺乏会导致精神紧张，甚至出现认知障碍、神经退行性病变和周围神经病［18］。Carney 等［19］发现，Vit B2的缺乏与精神疾病明显相关。

Vit B2是水溶性维生素，可随尿液和汗液排泄，故需每日补充。正是因为Vit B2的强亲水性，使其不能被动扩散通过细胞膜进入细胞，而需要转运蛋白的主动运输［20］。而主动运输与转运蛋白的量和活性成正相关，是可饱和的，故对那些转运蛋白表达量不足或活性较低的人群，即使补充Vit B2，也容易导致Vit B2缺乏。而RTB是Vit B2的酯化衍生物，具强脂溶性，可能不需要通过转运蛋白直接依赖浓度差扩散进入细胞，尤其是神经细胞，形成细胞的Vit B2库，保证细胞对Vit B2的需求，维持细胞的最佳生理状态。所以，RTB至少可以作为Vit B2的前体药物，发挥预防焦虑和缓解焦虑症状的作用，而且对于核黄素转运蛋白表达低或活性低的群体，其对焦虑症的缓解作用大于Vit B2。

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