小鼠局灶性脑缺血模型行为学指标相关性研究

刘家兰，邓礼娟，原欢欢，王 琴，徐晓玉

(西南大学药学院，重庆市药效评价工程技术研究中心，重庆 400715)

大脑中动脉是临床上缺血性脑血管病的易患部位，血管闭塞造成局部脑血流循环障碍［1］。局灶脑缺血模型是目前研究脑缺血疾病的经典模型，其成功率高，梗死范围稳定，损伤小，大鼠或者小鼠造模均可，线栓法虽然死亡率高，却是更适合于长期对脑缺血疾病研究的模型［2］。课题组长期致力于中药新药对脑缺血疾病的研究，曾建立过对局灶脑缺血大鼠前肢功能评价的一种新方法［3］。本文对药效学研究的一种实验方法进行评价。国内外已有大量关于线栓法致小鼠局灶脑缺血模型的构建方法，其损伤程度的评价指标移植于大鼠评价体系，但大鼠与小鼠在身体机能方面有很大差异，评价指标是否客观合理有待验证。Bederson等［4］研究认为神经系统体征评分与脑梗死体积明显相关，Shen等［5］发现术后自发活动与脑梗死体积明显相关。本文选取了国内外常用的神经功能评价方法，以经典的Longa等［6］五分法和脑梗死面积百分比为参照，考察线栓法小鼠局灶永久性脑缺血模型行为学指标间的相关性。以疗效确切的血管扩张剂葛根素［7］，自由基清除剂依达拉奉［8］治疗模型小鼠，观察所选指标能否用于评价药物对该模型的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级健康KM小鼠150只，体质量25～30 g，由重庆医科大学实验动物中心提供［许可证号:SCXK(渝)2007-0001］，实验动物使用许可证:SYXK(渝)2009-0002，环境适应1周。

1.2 药品与试剂 葛根素(纯度≥98%，四川玉鑫药业有限公司，批号:090602);依达拉奉注射液(吉林省辉南长龙生化药业股份有限公司，批号:2010050201);水合氯醛(国药集团化学试剂有限公司)，2，3，5氯化三苯基四氮唑(北京鼎国生物技术有限公司)。

1.3 脑缺血模型的建立 小鼠适应喂养1周后用于模型制备。术前禁食不禁水12 h，3.5%水合氯醛(35 mg/10 g)ip麻醉;颈部正中切口，剥离并暴露颈动脉三角;分离出左侧颈总动脉、颈内动脉及颈外动脉;用电凝器尖端凝断颈外动脉，在其根部扎口，将线栓(直径0.10 mm)插入颈内动脉，当栓线标记(离头端1 cm)在颈总动脉分叉处，略微感到阻力时停止插入，固定栓线，缝合皮肤。假手术组不插入线栓，其余处理同上，造模后3 h进行首次神经功能评分，弃掉因失血过多，造模时间超过15 min者。

1.4 动物分组 实验一:小鼠70只，♀♂各半，10只假手术组，60只用于模型的制备，造模成功的31只用于神经功能评分指标的观察。实验二:小鼠80只，♂，用于葛根素和依达拉奉对脑缺血模型的改善效果观察，将模型成功的63只小鼠随机分为模型组、葛根素组和依达拉奉组，每组21只;剔除造模后d 1～8死亡且无脑缺血病理改变的小鼠，最终用于神经功能行为学评分的动物为假手术组10只，模型组10只，葛根素组12只，依达拉奉组12只;术后3 h第1次尾iv给药，每天1次，连续7 d，假手术组和模型组尾静脉注射同等体积的生理盐水。

1.5 神经功能行为学测试 神经行为学评分:参照Longa等［6］五分法，术后 d 1、d 4 和 d 7 对小鼠进行评分。即0分，无神经损害症状;1.0分，不能完全伸展损伤对侧前肢;2.0分，屈曲姿势，旋转运动;3.0分，行走时向对侧倾倒;4.0分，不能自发行走，痉挛、昏睡，意识丧失。

神经综合功能评分:参照Petullo等［9］的行为学评价标准。术前3 d对小鼠进行训练，包括3个方面:神经肌肉功能、前庭运动功能和综合神经运动功能，总分20，分数越高，代表缺血性脑损伤越严重。

转角试验［10］:将小鼠放在两块30 cm×20 cm×1 cm的木板间，两木板呈30°角，两板之间有一小缝鼓励小鼠进入这个转角，将小鼠面朝转角放置于去转角的半路上，当小鼠走进转角时，两边的触须会碰到木板，此时小鼠会向前或向上移，最后会向左或向右转回。脑缺血小鼠会优先向非损伤侧转回，每次实验重复10次，记录下向右的次数。

爬板试验［11］:将小鼠放于一包有铜丝网25 cm×20 cm(孔径0.2 mm)的有机玻板上，先保持平板于水平位置，后逐渐竖起平板，直至小鼠不能攀爬而从平板上落下，记录该时平板轴线与水平面之间的角度(Holding angle)，每只小鼠重复3次，记平均值。即0 分，≥ 70°;1 分，≥ 65°～69°;2 分，≥ 60°～64.9°;3 分，≥ 55°～59.9°;4 分，＜55°。

1.6 脑梗死灶体积测定 术后d 8，神经功能评分后，断头取大脑，－20℃冷冻8 min，取出沿视交叉冠状切成约2 mm厚的4个切片，浸入37℃ 2%TTC溶液中避光染色15 min，4%多聚甲醛固定1 d，滤纸吸干，用小镊子分开红色和白色脑组织，称重，计算脑梗死质量占全脑的百分比。

2 结果

2.1 术后症状及成功率 术后造模成功小鼠，表现为活动减少，左眼微闭，行动迟缓，呼吸窘迫，进食困难，腹泻，皮毛竖立，脑损伤对侧前肢卷曲，呈追尾状转圈等症状，从d 1～8体重不断下降;假手术组仅左眼微闭，无神经功能缺损症状，体重变化较小(Fig 1)。实验一中，60只造模小鼠，8只术后无神经功能缺损症状，2只蛛网膜下腔出血，手术成功50只，成功率约为83.3%;实验二中70只造模小鼠，7只术后无神经功能缺损症状，4只蛛网膜下腔出血，手术成功59只，成功率为84.3%。

Fig 1 Weight of mouse after operation

2.2 术后死亡率 实验一中50只造模成功小鼠，从d 1～8，总共死亡19只，用于观察31只，死亡率38%;实验二中59只造模成功小鼠，从d 1～8，死亡25只，死亡率为42.3%。

2.3 神经功能指标的相关性 对术后小鼠d 1、d 4和d 7进行评分(Tab 1)。神经行为学与其他指标在d 1、d 4和d 7中的相关性存在差异。结果显示，神经行为学与神经综合功能评分、爬板试验和转角试验在术后d 1相关性最强，d 4神经行为学与神经综合功能仍相关，与其他指标无相关性(Tab 2)。

Tab 1 Neurological function scores of sham and ischemia mice

2.4 脑梗死百分比与神经功能指标相关性 将脑梗死百分比与脑缺血术后d 7的神经功能指标评分进行相关性分析。结果显示，脑梗死百分比的大小与神经行为学、神经综合功能评分和爬板试验均相关，与转角试验相关性差异无显著性(Tab 3、Fig 2)。

Fig 2 Correlation between infarction percentage and neurological function indicators

Tab 2 Correlation efficient between neurologicalbehavioral score and neurological function indicators(n=31)

2.5 药物对脑损伤小鼠的作用 根据以上神经功能指标的探讨，我们选取了神经行为学、神经综合功能和爬板试验观察药物对脑缺血小鼠的作用。术后d 1～8陆续有动物死亡，将最终存活下来并具脑缺血病理特征的小鼠进行统计。结果显示，葛根素与依达拉奉组在术后d 4和d 7脑损伤程度有明显的改善(Tab 4)。TTC染色显示梗死区为白色，正常区域为红色，假手术组均呈红色。模型组梗死区域较大，占据大脑皮层及海马区;与模型组相比，葛根素组和依达拉奉组梗死面积百分比减小(Tab 5、Fig 3)。

Tab 3 Correlation efficient between infarction percentage and neurological function indicators(n=26)

3 讨论

3.1 模型制备的成功要素 小鼠品系:不同小鼠品系造成的损伤程度不同，品系间的梗死体积不同主要是由大脑Willis环的解剖差异所致。昆明种小鼠不如BALB/c小鼠对脑缺血敏感，但梗死体积稳定，且不易死亡［12］。

Fig 3 Brain TTC staining of mice

Tab 4Effects of drug group on neurological function behavioral score(±s)

Tab 4Effects of drug group on neurological function behavioral score(±s)

＊＊P＜0.01 vs sham group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs model group

Indicator Group Dose/mg·kg－1 n d 1 d 4 d 7 Neurological behavioral scoreSham－100 0 0 Model － 10 2.00 ±0.68＊＊ 1.60 ±0.42＊＊ 1.50 ±0.42＊＊Puerarin 40 12 2.00 ±0.43 1.17 ±0.58## 1.17 ±0.58##Edaravone 4.5 12 2.08 ±0.52 1.33 ±0.65# 1.08 ±0.52##Neurological comprehensive function score Sham－100 0 0 Model － 10 9.8 ±1.60＊＊ 7.80 ±1.42＊＊ 6.80 ±0.42＊＊Puerarin 40 12 9.58 ±0.87 6.75 ±0.54## 5.92 ±0.67##Edaravone 4.5 12 9.58 ±1.16 6.63 ±0.71## 6.00 ±0.60##Inclined plane test score Sham － 10 0.20 ±0.42 0.30 ±0.67 0.20 ±0.42 Model － 10 3.00 ±0.67＊＊ 2.30 ±0.67＊＊ 2.10 ±0.57＊＊Puerarin 40 12 3.00 ±0.85 1.50 ±0.52## 1.42 ±0.51#Edaravone 4.5 12 3.17 ±0.58 1.75 ±0.62## 1.33 ±0.65#

Tab 5Effect of drug on infarction size percentage(±s)

Tab 5Effect of drug on infarction size percentage(±s)

＊＊P ＜0.01 vs sham group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs model group

Group Dose/mg·kg－1 n Brain total weight/g Infarction weight/g Inf arction percentage/%Sham － 10 0.32 ±0.03 0 0 Model － 10 0.30 ±0.05 0.05 ±0.02 17.23 ±6.21＊＊Puerarin 40 12 0.29 ±0.05 0.04 ±0.01 14.48 ±3.20#Edaravone 4.5 12 0.30 ±0.04 0.04 ±0.02 13.63 ±4.75##

体重和性别:小鼠个体的大小对手术损伤的耐受力和模型成功与否有一定影响。选取体重为26～30 g小鼠，大小适中，制得的模型均一。术后小鼠存活率与性别也有很大关系，♂的耐受性较♀好，存活时间更长。

操作过程:造模过程中，尽量避免损伤血管周围组织和迷走神经。可用小号针头在插线端血管扎一小口，插入线栓时要调整好进线方向，轻柔慢进，如在10～11 mm的位置遇到阻力，证明线栓进入位置正确，若没有，退出线栓调整方向再进。可不用动脉夹，在ICA近脑端用缝合线栓个活结，线栓插入后用镊子轻轻拉开活结即可，插入深度不易超过12 mm。

麻醉剂:麻醉剂对模型的成功影响较大，国内常用水合氯醛，易引起呼吸道堵塞。造模过程中，如果遇到呼吸抑制的小鼠，可用小直镊夹取少许棉花伸入气管中，取出黏液，同时节律性地压迫心脏，小鼠可快速恢复正常呼吸，减少死亡率。

3.2 模型中指标的选择 在脑缺血疾病的观察中，如何选取能真实反映疾病程度的指标相当重要。神经功能行为学指标对慢性脑缺血疾病的研究具有重要作用。实验表明，线栓法制备的小鼠局灶永久性脑缺血模型死亡率较高，脑梗死体积恒定，神经功能障碍明显。Longa评分与实验中所选指标在短期内相关性强，相关程度随时间而降低;脑梗死百分率与多数指标呈正相关。葛根素、依达拉奉能明显降低局灶性脑缺血损伤，表明可通过行为学指标分值预测脑梗死程度。在行为学指标的定量检测中，不同指标反映不同的功能，神经行为学主要反映前肢功能和偏瘫症状，不需借助任何设备，是最为经典简单易行的评价方法，分值设置少间距大，对局灶脑缺血损伤的药效观察敏感性较差，可以考虑增加分值数，缩短间距;神经综合功能反映了肌肉运动功能、前庭运动功能和平衡综合能力，与梗死质量百分比的相关性最强，对脑缺血疾病的药效观察敏感性较高，是较为理想的行为学评价方法，但评价过程较复杂;爬板试验反映协调和平衡能力，与梗死体积的相关性较强，稳定且操作简单，可用于脑缺血疾病的药效观察;转角试验用于测定前脑和纹状体的损伤程度，与梗死质量百分比无相关性，用于药效的观察可能需加大样本量以减少个体差异。为降低观察者主观因素和个体差异的影响，药物对脑缺血损伤的评价，建议加大样本量和多指标综合评价。国内外关于小鼠神经功能行为学指标较多，如:烟囱试验［13］、旋转试验［14］、梯子试验［15］、圆柱体试验［16］、悬挂试验、水谜宫、肌力测试等，分别从脑损伤引起的肌肉、平衡、运动、记忆和认知功能障碍进行评价，对急性脑缺血和长期神经功能修复进行观察，但是否可用于对小鼠永久局灶性脑缺血模型的评定尚需进一步实验。

3.3 模型的不足 本实验是将大鼠的线栓法局灶脑缺血模型制备移植于小鼠身上。此模型中需凝断颈外动脉，虽然对神经功能缺损的观察并无影响，但与临床的脑缺血病理模型有差距，有待进一步改进。

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