脂溶性儿茶素类化合物的制备研究进展

朱晋萱 金青哲 张士康 朱跃进

（1.江南大学食品学院，江苏无锡 214122；2.中华全国供销合作总社杭州茶叶研究院，浙江杭州310016）

脂溶性儿茶素类化合物的制备研究进展

朱晋萱1，2金青哲1*张士康2*朱跃进2

（1.江南大学食品学院，江苏无锡 214122；2.中华全国供销合作总社杭州茶叶研究院，浙江杭州310016）

儿茶素类化合物是一类具有多种生理活性的多酚类抗氧化剂，本文综述了国内外利用分子修饰法制备脂溶性儿茶素类化合物的进展。化学法主要利用酰氯在化学催化剂作用下反应制备脂溶性儿茶素，但是酰化反应发生的位点有所不同，总的来说酰基供体碳链长度一般大于等于8；酶法主要利用脂肪酶使脂肪酸或脂肪酸酯通过直接酯化或酯交换反应制备脂溶性儿茶素，在儿茶素及其化合物上键合烷基，由此提高了儿茶素类化合物在油脂体系中的溶解度，拓展了其应用领域。

脂溶性 儿茶素 茶多酚 分子修饰

儿茶素类化合物是茶多酚的主要成分，包括儿茶素 （C）、表儿茶素 （EC）、表没食子儿茶素（EGC）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）[1]。其中又以EGCG的含量最高，也是儿茶素类化合物中抗氧化作用最强的一种成分[1-3]。儿茶素类化合物的结构通式如图1所示。

儿茶素类化合物是一类具有多种生理活性的多酚类抗氧化剂，其活性部位为分子中的酚羟基，具有抗氧化能力强、安全性高的优点，是一种优良的天然抗氧化剂。但酚羟基的亲水性质导致了其易溶于水不易溶于油的溶解特性，这就限制了其在油脂体系中的应用。

图1 儿茶素类化合物的结构通式Fig.1 The general structure of Catechins Compounds

增强儿茶素类化合物在油脂中溶解度的方法主要有溶剂法、乳化法和分子修饰法等三种[4]，但前两者并未改变儿茶素化合物的分子结构，仅仅是通过物理溶解或乳化方式使儿茶素化合物分散在体系中，其效果较分子修饰差，形成的抗氧化体系也没有分子修饰法所形成的体系稳定[5]。这是由于分子修饰法利用生物或化学合成途径，将某种儿茶素类化合物分子结构的某些部位酰化或酯化，使得新构成的分子由水溶性转变为脂溶性。研究证实，分子修饰后的脂溶性儿茶素类化合物在油脂体系中的抗氧化效果要优于天然儿茶素类化合物以及BHA[6]和BHT[7]，一定条件下甚至优于TBHQ[8]，其原因是脂溶性儿茶素类化合物在油脂体系中溶解度较改性前增大[9,10]，与油脂中自由基接触的几率增加，从而增强了抗氧化效果。

目前所用的分子修饰法主要是化学修饰法和酶修饰法，分别加以介绍。

1 化学修饰法

化学修饰法主要是利用有机试剂作为酰化或酯化的酰基供体和反应催化剂，整个反应过程由有机试剂的种类、浓度和反应温度控制，所得副产物较多。但是化学修饰法成本较低，容易操作，是目前研究比较多，相对比较成熟的方法。化学修饰法目前主要有氧酰化法 （酰化反应发生在酚羟基上）和碳酰化法（酰化反应发生在芳环上）两种[11]。

1.1 氧酰化法

儿茶素类化合物分子中的多个酚羟基可与酰氯等酰化试剂在一定的条件下发生O-酰基反应生成酚酯，该酯化反应是一个亲核反应。酰化剂羰基上的电子位移使碳上带有部分正电荷，是一个亲电试剂。被酰化物的羟基上具有未共用电子对，因此易于对羰基碳原子发生亲核性攻击，是一个亲核试剂。其反应速度和平衡常数与反应物醇（或酚）上的亲核性强弱及分子的空间位置有关，亲核性越强，空间位阻越小则反应越易进行。而对酰化剂来说，其羰基上阳电荷的大小与脱离基团（在羧酸中为“-OH”，在酰氯中为“-Cl”）的负电性大小有关，即脱离能力越强，碳上的阳电荷增加而使反应活性增加，相反如果脱离基团上的电子易于转移，脱离能力减弱，则羰基上的阳电荷减少，其酰化能力就减弱。通常采用的酰化剂为酰氯，其反应式可以简化表示为 R-OH+R’COCl→ ROCO-R’[11,12]。

1.1.1 酰氯氧酰化法

早在20世纪末，沈生荣等[13]已经利用油酸酰氯将水溶性EGCG修饰成油溶性EGCG，修饰后产物的性能较好。近期，许多作者采用长碳链的酰氯作为酰基供体与儿茶素类反应，反应温度一般偏高。为了控制儿茶素类物质的氧化，常用N2对其进行保护[6,12,14,16]。

旷英姿等[12]通过月桂酰氯制备了脂溶性茶多酚，得到制备脂溶性茶多酚的最佳条件是：在氮气气氛中，反应温度控制在75～78℃，用乙酸乙酯作溶剂，将月桂酰氯与茶多酚以物质的量之比为5∶1反应而得到，得到的产品脂溶性较好。张健希等[14]选用3种不同的酰氯 （癸酰氯、月桂酰氯、椰油酰氯）作为原料与茶多酚进行反应，合成脂溶性茶多酚，考察了物料配比、催化剂用量和反应温度对改性反应的影响，发现茶多酚的脂溶性和抗氧化活性之间存在着一定的关系，得出脂溶性含量在50%～60%的改性产品抗氧化性能最好。通过比较不同酰氯对改性产物活性的影响，得出最佳改性试剂应为碳原子数在12以上的直链饱和脂肪酰氯。综合比较后看出酯化修饰的茶多酚抗氧化性的优势是最明显的，它的抗氧化能力优于BHA，与TBHQ持平甚至略好。曾磊等[15]用响应面回归分析法对茶多酚化学改性的工艺条件优选，确定出水溶性茶多酚与硬脂酰氯改性的最佳工艺条件为：茶多酚、硬脂酰氯、催化剂质量比为 1∶1.21∶0.07， 反应温度 68.7℃， 反应时间8.5h。在此条件下保护系数为3.25，表现为抗氧化效果最好。在本实验中确定改性茶多酚的最适添加量为200mg/kg。虽然该实验中脂溶性茶多酚中仍存在酚羟基，但其数量较茶多酚中的少，而且制得的脂溶性茶多酚的具体结构还有待于进一步的研究。王巧娥等[16]重点研究了反应物配比、催化剂用量、反应温度和气氛对反应的影响以及粗产品的纯化方法，并初步探讨了其抗油脂自动氧化的特性。结果表明，最佳反应条件为：茶多酚、癸酰氯、催化剂质量比为 1∶2.3∶0.05，于氮气保护、100℃下反应4h后水洗处理。所得产品具有与台成抗氧化剂BHT相当的抗氧化活性。

1.1.2 脂肪酸氧酰化法

采用普通脂肪酸作为酰化反应的酰基供体，此反应同样需要适当地控制温度、催化剂、反应气氛等因素，使反应在较温和的条件下进行。此外，反应物的量比也是关键因素，它决定着产物的油溶性和抗氧化性。

聂芊等[17,18]采用化学方法制备了豆油脂肪酸茶多酚酯，直接的酰基供体是由豆油脂肪酸制备的豆油脂肪酸酐。通过红外光谱对产物结构进行了表征，并将豆油脂肪酸茶多酚酯作为油脂的抗氧化剂，添加到大豆油中，考察了其抗氧化性能。结果表明，制备豆油脂肪酸茶多酚酯较佳条件是：茶多酚与豆油脂肪酸的质量比为1∶2.5，在氮气保护下，温度80℃，反应时间5h。豆油脂肪酸茶多酚酯具有较好的油溶性，可提高豆油的抗氧化性能，且豆油脂肪酸茶多酚酯的抗氧化活性优于茶多酚和BHT。但是该研究中同样没有对产物的详细结构作分析讨论。

1.2 碳酰化法

儿茶素A环的6位和8位具有较高的亲核活性，易与酰氯等亲电试剂发生亲电取代反应，即C-酰基化反应（即Friedel-Crafts酰基化反应）[7,8]。碳酰化法即是在茶多酚的苯环结构上引入酰基，由于酰基的吸电子效应与空间位阻效应，使同一个苯环上难以进行第二次碳酰化，但由于茶多酚分子有多个苯环结构，因此不同的苯环可能分别被酯化，形成多酯衍生物。

卢聪聪[11]首先是改进了常见的氧酰化法，酰基供体采用亚硫酰氯和含有12碳～18碳的脂肪酸反应制备的脂肪酰氯。制备脂溶性茶多酚采用反应温度为30～45℃，最佳的反应时间8～9h，茶多酚、脂肪酰氯、催化剂摩尔比为 1∶2.0～2.5∶3.5～4.5。以89%～91%乙醇溶液溶解脂溶性茶多酚（LTP）初品，用低极性有机溶剂萃取，浓缩，干燥得到氧酰化法茶多酚。然后考虑到氧酰化反应会减少酚羟基数量，尝试了在茶多酚的苯环结构中的碳原子上引入酰基，获得了一种碳酰化反应制备脂溶性茶多酚的方法。使用三氯化铝为催化剂，硝基苯为反应溶剂，酰基供体仍为亚硫酰氯和含有12碳～18碳的脂肪酸反应制备的脂肪酰氯。儿茶素、催化剂、酰化剂最佳反应物比例为1∶2～3.5∶2～3.5，反应完毕后萃取，分液，浓缩，得到碳酰化脂溶性茶多酚固体。经测定，碳酰化脂溶性茶多酚较氧酰化脂溶性茶多酚具有更强的脂溶性。两种脂溶性茶多酚都具有良好的抗氧化性能，从抗氧化性和在油脂体系中的稳定性来说都优于除TBHQ外的其他抗氧化剂。

茶多酚的化学法改性工艺已比较成熟，但是化学法本身存在的缺陷也很明显，一是修饰过程中酚羟基损失较大，导致儿茶素抗氧化活性降低，而且酰化程度越高，它的损失越大。二是长碳链的引入对周围酚羟基产生的屏蔽作用使其参与抗氧化反应的空间位阻增大；同时长碳链还会造成聚集，达不到增溶效果。此外化学酰化反应并不是完全定向酰化，其产物是一种含有单酯、双酯甚至多酯及未反应茶多酚的混合物[19,20]。同时，缺乏专一性的催化条件不利于产物的结构鉴定及其它后续研究。而且化学法中使用的有机反应试剂也限制了改性茶多酚在食品中的应用。所以，近年来，人们越来越多把目光投向了脂肪酶催化修饰法。

2 酶修饰法

Sakai等[21]利用羧酸酯酶进行酯交换制备脂溶性儿茶素。酰基供体为含有1～10个碳原子的烃基。反应体系中，每1mol游离儿茶素通常需要大于1～10mol的酯类化合物。羧酸酯酶的使用量约为每1g游离儿茶素对应10～100000UI，最好是100～5000UI之间。反应的温度和时间应该保持在20～60℃和1～100h之间，反应的pH应为4～7。为了确定其抗氧化效果，将得到的酰基化儿茶素以0.01～0.1%的重量浓度加入油脂中，得到了安全、有效的抗氧化反应。此抗氧化剂也可与其它常用抗氧化复合使用。

Lambusta等[22,23]由儿茶素或儿茶素五乙酸酯出发，在单一酶假单胞菌脂肪酶的作用下，得到若干儿茶素单乙酸酯或多乙酸酯，提高其疏水性。利用醋酸乙烯酯合成儿茶素乙酯的反应如图2所示。

图2 用醋酸乙烯酯酶法合成儿茶素乙酯Fig.2 enzymatic synthesis of acetylcatechins with vinyl acetate

该反应的儿茶素浓度为15.3g/L，非固定化酶浓度为50g/L，酰基供体为醋酸乙酯，最适溶剂为乙腈，在45℃下反应48h，产物为5-O-儿茶素乙酯（得率40%）和7-O-儿茶素乙酯（得率32%）的混合物。利用儿茶素与醋酸乙酯的直接反应得到了很好的衍生物产率。

该酶还可利用儿茶素五乙酸酯，在丁醇/四氢呋喃体系中，通过延长反应时间，分步转化为儿茶素三乙酯和儿茶素单乙酯，即3-O-乙酰衍生物。在该反应中，C-3位置酯基团的保留是由儿茶素的结构决定的，由此出现了4种不同的3-O-儿茶素乙酰产物，如图3所示。

图3 酶法合成儿茶素三乙酯和儿茶素单乙酯Fig.3 enzymatic synthesis of triacetylcatechin and monoacetylcatechin

而Gao等[24]以7-α-D-葡萄糖苷-儿茶素（10～30g/L）为底物，以肉桂酸乙烯酯，咖啡酸乙烯酯，香豆酸乙烯酯为酰基供体，使用Novozym 435脂肪酶（15～44g/L）作催化剂，实验得最佳溶剂体系为叔丁醇∶吡啶为 9∶1 或者乙腈∶吡啶为 9∶1， 产物为 7-α-D-葡萄糖苷-儿茶素的6〞-O-肉桂酸酯（70%）。

赵峰[25]初步探讨了酶法修饰，选用丁醇、叔戊醇为反应介质，分别以丁酸乙烯酯、月桂酸乙烯酯为酰基供体，确定叔戊醇为实验反应介质，丁酸乙烯酯为酰基供体。随后对不同水活度下的反应情况进行研究。研究发现，在叔戊醇体系中，水活度在0.11～0.85之间，Novozym 435脂肪酶可以选择性催化EGCG与丁酸乙酯的反应。反应后混合液通过LCQDECA液质联用仪进行了初步鉴定，结果表明EGCG分子上有单一取代的修饰产物，EGCG与酰化反应产物红外图谱对比表明，酰化EGCG主体结构与EGCG类似，其分子中引入了四碳链的烷基，但是酰化位点并不确定。

对产物的检测来说，虽然有作者使用了红外谱图进行检测[12]，但是笔者认为一般使用到的更有效的方法是薄层液相色谱（TLC）[25]、高效液相色谱（HPLC）[26,27]以及核磁共振（包括12C谱和1H谱）[28,29]、液质联用（LC-MS）等手段，也有使用气质联用（GC-MS）[11]来进行分析的。通过这些分析检测方法，在合适的条件下可以得到较为详细的分子信息[30]。

虽然用酶法可定向进行酰化反应，但反应成本较高，离广泛推广应用还有很长一段路要走[31]。

3 结语

脂溶性儿茶素目前主要是采用化学酰化法获得，当前较多的研究集中在以中长碳链脂肪酸酰氯为酰基供体制备脂溶性EGCG以用于油脂的抗氧化，总的来说碳酰化法在保留儿茶素抗氧化活性方面要优于氧酰化法。但脂溶性儿茶素的分子修饰迄今为止还未有十分令人满意的效果，化学法存在其自身固有的缺陷，如溶剂残留、反应温度较高、酰化程度难以控制、产物分析复杂等。故酶法定向酰化反应是制备脂溶性儿茶素最有潜力的方法，它反应条件温和，副反应产物少，虽然目前已经有一定的探索，但还是以儿茶素乙酰相关研究为主，在长碳链酰化以增加脂溶性方面仍需进行深入的研究。例如，催化条件的优化，检测分析手段的确定等，同时，酶催化脂溶性产物的抗氧化效果、溶解性、稳定性和生物活性等也是将来值得研究的课题和方向。

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Developments in Preparation of Lipid-Soluble Catechins Compounds

ZHU Jin-xuan1,2,JIN Qin-zhe1*,ZHANG Shi-kang2*,ZHU Yue-jin2
(1.School of Food Science and Techology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;2.Hangzhou Tea Research Institute,CHINA COOP,Hangzhou 310016,China)

Catechin compounds is one kind of polyphenol antioxidant that possess a great physiological activties.In this paper,progress of lipid-soluble catechins’preparation that use molecules modification were reviewed.Chemical method is mainly using carbonyl chlorides and catechin compounds in reaction under the role of chemical catalyst to prepare lipid-soluble catechins.But acylation reaction happened at different locus.The carbon chain length of acyl donors generally is more than 8.Enzymatic modification is mainly using fatty acid or fatty acid ester with catechins under the role of lipase,then direct esterification or ester exchange happened to get lipid-soluble catechins.Alkyl is bonded in catchin compounds,thus solubility in oil system of the catechin compounds is raising,and expand the application fields.

Lipid-soluble,Catechins,Tea polyphenol,Molecular modification

2012-02-09

浙江省茶产业技术创新联盟项目，脂溶性茶多酚绿色制备及在食品中的应用；院级基金项目，脂溶性茶多酚绿色制备及在食用油中的应用技术研究。

朱晋萱（1987-），女，湖北随州人，在读硕士研究生，主要从事脂质深加工与开发工作。

*通讯作者：jqzwuxi@163.com;zsk6510@126.com