水葫芦总黄酮最佳提取工艺的研究

陆广汇

（江苏省建湖县人民医院，建湖224700）

水葫芦 （Water Hyacinth），属雨久花科、凤眼莲属［1］。原产南美，1884年作为观赏植物被带到美国的一个园艺博览会上，当时被预言为 “美化世界的淡紫色花冠”。1901年，水葫芦被引入中国，已成为中国危害严重的外侵植物。现在这种植物已成为我国大部分境内迅速扩散传播的恶性杂草［2］。水葫芦包含的主要成分有皂苷、挥发油和黄酮等，其乙醇提取物具有很强的抗氧化和自由基消除能力，在诸多类型天然抗氧化剂中［3］，黄酮类成分能有效减轻细胞的过氧化胁迫，阻止低密度脂质的过氧化等作用。为了综合利用水葫芦，使它变废为宝［4］，我们用植物类黄酮的独特优势，确定水葫芦总黄酮的最佳提取工艺，为后续开辟安全、无副作用的绿色化妆品提供便利［5］。

1 水葫芦提取工艺研究

1.1 材料来源及处理 干燥水葫芦打粉过40目筛备用［6］。

1.2 正交实验表头设计及总黄酮的提取 表头设计见表1，正交实验见表2。

表1 表头设计

表2 正交实验表

上述试验药材加热回流得到乙醇提取液，挥去乙醇［7］，干燥后得浸膏，称重 （g），如表3。

表3 浸膏质量

1.3 紫外法分光光度法 （UV）测定样品中总黄酮含量

1.3.1 仪器与试剂 752紫外可见分光光度计 （上海精密科学仪器有限公司）；芦丁对照品：中国药品生物制品鉴定所 （100080－200306）；甲醇：色谱纯；亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠：分析纯；蒸馏水。

1.3.1 溶液配制 （1）5%亚硝酸钠、10%硝酸铝、1mol／L NaOH溶液。称取亚硝酸钠2.5g置50ml烧杯中，加水配制成5%亚硝酸钠溶液；称取硝酸铝5g置50ml烧杯中，加水配制成10%硝酸铝溶液；称取NaOH 8g置200ml烧杯中，加水配制成1mol／L NaOH溶液。（2）对照品溶液配制。精密称取干燥至恒重的芦丁对照品50mg置100ml容量瓶中，加甲醇适量，置水浴上微热，使芦丁溶解，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，得0.5mg／ml对照品溶液。

1.3.3 标准曲线制备 精密量取对照品溶液 （0.5mg／ml）1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0ml分别置于25ml容量瓶中，各加水至6.0ml，加5%亚硝酸钠溶液1ml，充分摇匀，放置6min，加入10%硝酸铝溶液1ml，充分摇匀，放置6mim，加入1mol／L NaOH溶液10ml，再加水至刻度，摇匀，放置15min，于分光光度计上以第一份溶液为空白，在510nm波长［8］，钨灯，测定吸光度值A，见表4，以A为纵坐标，对照品溶液浓度C为横坐标，绘制标准曲线。经回归分析得回归方程：Y＝11.711X，相关系数R2＝0.9991，r＝0.9995。

表4 吸光度值A

1.4 样品溶液总黄酮含量测定 精密称取浸膏0.25g，置100ml容量瓶中，加甲醇至刻度，再分别量取5ml置25ml容量瓶中，照标准曲线制备项的方法，自 “各加水至6ml”起依法操作，直至测定出样品的吸光度值［9］，再根据标准曲线计算总黄酮含量，见表5。

表5 样品溶液总黄酮含量测定

1.5 高效液相 （HPLC）测定样品中芦丁含量

1.5.1 仪器与试剂 Waters2690高效液相色谱仪，996PDA二极管矩阵检测器，Millennium32色谱管理系统；芦丁对照品：中国药品生物制品鉴定所 （100080－200306）；甲醇：色谱纯；重蒸馏水：自制。

1.5.2 方法与结果 色谱条件的选择和系统适用性试验：Alltima C18柱 （4.6×250nm；5μm），柱温为30℃；以甲醇－0.4%磷酸水 （30：70）为流动相，流速为1.0ml／min；检测波长为360nm。在上述色谱条件下，理论塔板数按芦丁计算为6130［10］。

1.5.3 溶液的配置 对照品溶液的制备：精密称取芦丁对照品适量，加甲醇制成每1ml含100μg的溶液。样品溶液的制备：精密称取水葫芦浸膏0.25g，置100ml容量瓶中，加甲醇至刻度。精密吸取1ml溶液置25ml容量瓶中，加甲醇至刻度。

1.5.4 方法学考察 ①外标一点法［11］：称取芦丁对照品10mg，精密称定，加甲醇制成对照品贮备液，再精密吸取上述对照品溶液0.8ml，用甲醇定容至5ml，吸取20μl对照品溶液注入液相色谱仪测定，得到其峰面积4129。②样品含量测定：分别精密吸取样品溶液20μl注入高效液相色谱仪测定，根据外标一点法计算结果，见表6。

表6 样品含量

1.6 浸出物量的测定——冷浸法 精密称取浸膏4g，置100ml锥形瓶中，精密加70%乙醇，密塞，冷浸，前6小时内时时振摇，再静置18小时，用干燥滤器滤过，取20ml滤液［12］。挥去乙醇，干燥精密称重 （g），见表7。

表7 浸出物含量

2 结果

采用SPSS13.0进行结果统计。

2.1 紫外SPSS统计结果 见表8

表8 总黄酮含量正交结果

2.2 HPLCSPSS统计结果 见表9。

表9 芦丁含量正交结果

3 正交加权统计结果 见表10。

表10 正交加权统计结果

根据紫外、液相、浸出物结果的加权，得出最佳提取工艺：70%的8倍于原药材体积乙醇，提取3次，1.5h／次。

5 讨论

水葫芦中含有较为丰富的黄酮类成分［13］，正交试验中影响提取的效率的4个因素 （乙醇浓度、乙醇体积、提取的时间、提取的次数）中提取的时间和提取的次数影响较小，而乙醇的浓度影响显著。因此用7%的8倍于原药材体积乙醇，提取3次，1.5h／次，提取较完全［13］。

水葫芦乙醇提取物具有很强的抗氧化和自由基消除能力，而活性氧与自由基的产生被认为与人类的众多疾病的发生密切相关。在诸多类型天然抗氧化剂中［14］，黄酮类成分能有效减轻细胞的过氧化胁迫，阻止低密度脂质的过氧化，预防和治疗多种疾病。通过对水葫芦黄酮化合物提取工艺的研究，可以综合利用水葫芦，变废为宝［15］，同时可以扩大药源，极大的利用资源，具有良好的社会效益［16－17］。

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