HPLC法测定蒙药蓝盆花中木犀草素和芹菜素的含量

2012-12-03王国英薛培凤布仁高建萍内蒙古医学院药学院呼和浩特00059内蒙古自治区食品药品检验所呼和浩特000

中国药房 2012年15期

王国英，薛培凤，布仁，高建萍（.内蒙古医学院药学院，呼和浩特00059；2.内蒙古自治区食品药品检验所，呼和浩特 000）

蒙药蓝盆花又称蒙古山萝卜花，来源于川续断科植物窄叶蓝盆花Scabiosa comosa Fisch.Ex Roem.et Schult和华北蓝盆花Scabiosa tschilliensis Grunning的干燥花序，蒙药名为陶森-陶日莫，主产于内蒙古、黑龙江、吉林、辽宁、河北等省区[1～3]。蒙医在临床上用其清热、清“协日”，主要用于治疗肺热、肝热、咽喉热[4]、肝火头痛、发烧、肺热咳嗽、黄疸等病[5]。

蓝盆花中含有黄酮类化合物，现代药理研究证明其总黄酮具有抗炎、解热、抗氧化、对肾缺血再灌注损伤的保护作用、镇静、舒张外周血管、降低血压、免疫、胰脂肪酶抑制作用等功能[6，7]。木犀草素具有消炎、抗过敏、抗肿瘤、抗菌、抗病毒等作用[8]；芹菜素具有抗肿瘤、抗炎、降血压、舒张血管、抗动脉硬化、抗焦虑、抗菌、抗病毒等作用[9]。两者药理作用与蓝盆花的药理作用相近。因此，建立同时测定蓝盆花中木犀草素与芹菜素的含量测定方法，对蒙药蓝盆花的质量标准研究具有重要意义。

1 仪器与试药

HITACHI L-2000高效液相色谱（HPLC）仪，含二元泵、二极管阵列检测器、自动进样器、柱温箱（日本日立公司）；DZKW-D-2电热恒温不锈钢水浴锅（北京市永光明医疗仪器厂）；AL-204电子天平（上海微川精密仪器有限公司）；AS3120超声清洗机（昆山禾创超声仪器有限公司）；RE-52 c旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）。

木犀草素、芹菜素标准品（北京伟业科创科技有限公司，纯度均＞98%）；甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。7批（批号：20080709、20090321、20090815、20090720、20090918、20090729、20090701）不同产地和商品蓝盆花样品，经内蒙古医学院药学院庞秀生教授鉴定均为川续断科植物华北蓝盆花S.tschilliensis Grunning的干燥花序。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Phenomenex ODS-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.4%磷酸（59∶41）[10]；流速：1mL·min－1；柱温：30℃；检测波长：345 nm；进样量：20 μL。色谱见图1。

2.2 混合标准品溶液的制备

分别取经40℃减压干燥至恒重的木犀草素和芹菜素标准品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL中含木犀草素0.476 mg、芹菜素0.475 mg的混合标准品溶液。

图1 高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatograms

2.3 供试品溶液的制备

取本品粗粉（粉碎，过40目筛）约1 g，精密称定，置圆底烧瓶中，加85%甲醇60 mL，85℃回流提取2次，每次2 h，滤过，洗净药渣，减压回收溶剂至干，用甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中，摇匀，经0.45 μm滤膜滤过，即得。

2.4 线性关系考察

精密吸取“2.2”项下混合标准品溶液1 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，精密吸取3、6、9、12、15、18 μL，按上述色谱条件进样测定。以对照品进样量（X，μg）为横坐标，峰面积积分值（Y）为纵坐标，进行线性回归，得木犀草素和芹菜素的回归方程分别为Y＝2×107X+28601（r＝0.9995，n＝6）、Y＝2×107X－5798.1（r＝0.9996，n＝6）。结果表明，二者进样量分别在0.143～0.857、0.143～0.855 μg范围内与各自峰面积积分值呈良好线性关系。

2.5 精密度试验

精密吸取“2.2”项下混合标准品溶液20 μL，按上述色谱条件重复进样5次，计算峰面积。结果，木犀草素的RSD＝1.03%（n＝5），芹菜素的RSD＝0.95%（n＝5），表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验

取同一批样品适量，按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，照上述色谱条件测定。结果，木犀草素含量的RSD＝1.28%（n＝6），芹菜素含量的RSD＝0.97%（n＝6），表明该方法重复性良好。

2.7 稳定性试验

取同一供试品溶液适量，分别于制备后0、1、2、3、4、6、8 h进样测定。结果，木犀草素的RSD＝1.52%（n＝7），芹菜素的RSD＝1.27%（n＝7），表明供试品溶液在8 h内稳定。

2.8 加样回收率试验

称取已知含量的同一批样品（批号：20080709）适量，共6份，精密称定，分别按相当于药材含量50%的量加入混合标准品溶液，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，照上述色谱条件进样测定，计算加样回收率，结果见表1。

2.9 样品含量测定

取不同批次的样品，分别按“2.3”项下方法制备3份供试品溶液，照上述色谱条件进样测定，计算样品中木犀草素和芹菜素的含量，结果见表2。

由表2可见，批号为20090701的样品中木犀草素和芹菜素的含量较低，可能是由于采集时间为7月初，正值花蕾初期（蓝盆花的花期在7～9月），所以含量较低。

3 讨论

3.1 检测波长的选择

木犀草素和芹菜素在340、350 nm波长处均有较大吸收，但由于木犀草素在350nm波长处的吸收峰最大，芹菜素在340 nm波长处的吸收峰最大，综合考虑，选择345 nm作为检测波长。

表1 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 1 Results of recovery of test（n＝6）

表2 样品含量测定结果（n＝3）Tab 2 Results of content determination of samples（n＝3）

3.2 提取方法考察

本试验首先对超声提取方法和回流提取方法进行了比较，结果表明回流提取效果要比超声提取效果好。随后又通过四因素三水平正交试验对回流提取方法进行了优化，因素水平分别为甲醇浓度（100%、85%、70%）、物料比（20、40、60）、提取时间（1、1.5、2 h）、提取次数（1、2、3次），得出最优试验条件：浓度为85%的甲醇作为提取溶剂，物料比为60，提取时间为2 h，提取次数为2次。