瘤内注射用姜黄素温敏凝胶的处方筛选及pH值的确定

高萌，张成鸿，鲍旭，蒋妮，何艳，田舸，田燕#（.大连医科大学药学院，辽宁大连6044；.大连医科大学形态学实验室，辽宁大连 6044；.大连儿童医院药剂科，辽宁大连 600）

经皮无水乙醇注射疗法（percutaneous ethanol injection therapy，PEIT）是一种应用广泛、疗效肯定的瘤内注射疗法，尤其对于肿瘤直径≤3 cm的肝癌有很好的治疗效果。但乙醇会从针孔外漏到肝包膜外而引起剧烈疼痛，或经小血管进入循环系统引起不良反应，对肝组织的毒性较大，不适于肝功能差的患者。据文献[1]报道，若将药物制备成温度敏感型原位凝胶（以下简称温敏凝胶）并采用瘤内注射的给药方式，既可以避开首关效应以及在消化道和胃肠道中的降解，减轻化疗药物的不良反应，又克服了瘤内注射液体制剂易扩散的缺点，达到靶向给药和延缓药物释放的目的。因此，笔者选择药用辅料泊洛沙姆为基质制备瘤内注射用姜黄素温敏凝胶，在弥补PEIT不足的前提下，达到更好的治疗效果。

温敏凝胶在贮藏条件（4℃）下是自由流动的液体，进入体内后可在注射部位发生相转变形成半固体状态凝胶，能达到局部给药或延缓药物释放的目的[2]。其中，用泊洛沙姆407（P407）制备的凝胶表面光滑柔软，在注射部位没有明显的异物感、无毒无刺激、生物相容性好[3]，是常用的制备温敏凝胶的辅料。姜黄素（Curcumin）是中药姜黄中的有效成分，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗菌、保肝等多种药理活性[4]，是一种高效低毒的天然抗癌药物，对小鼠腹水型肝癌高淋巴道转移细胞株有很强的抑制作用[5]。有关姜黄素制剂的报道较少，其主要原因是姜黄素水溶性差、不稳定且易降解[6]，故体内吸收差。笔者选择P407、P188为基质，聚乙二醇400（PEG400）、1，2-丙二醇、磷酸盐缓冲液为溶剂，通过正交试验筛选姜黄素温敏凝胶的最佳处方，通过稳定性试验确定其最适宜pH值，从而提高姜黄素的稳定性，为制备姜黄素制剂提供试验依据，使其具有更好的开发和应用前景。

1 仪器与试药

1100型高效液相色谱（HPLC）仪（美国安捷伦公司）；Krom Asil C18柱（大连江申分离科学技术公司）；NDJ-7旋转式黏度计、FA1104万分之一电子天平（0.1 mg），均购于上海精密科学仪器有限公司；501超级恒温器（上海市实验仪器厂）；79-1磁力加热搅拌器（金坛市医疗仪器厂）；PB-20标准型pH计（北京赛多利斯仪器系统有限公司）。

姜黄素原料药（陕西森弗生物技术有限公司，纯度：95%，批号：20101213）；姜黄素标准品（成都曼思特生物科技有限公司，纯度：98%，批号：20110302）；P407（批号：119 K0073）、P188（批号：129 K0055），均购于美国Sigma公司；PEG400（分析纯，天津市福晨化学试剂厂，批号：20080701）；1，2-丙二醇（分析纯，天津市化学试剂一厂，批号：990428）；乙腈（色谱纯，美国Tedia公司，批号：1009262）；冰醋酸（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20090706）；姜黄素温敏凝胶（大连医科大学药剂学教研室自制，批号：20110301、20110302、20110303，规格：2 mg·mL－1）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件[7]

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为黏合剂的Krom AsilC18柱（150mm×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈-2%冰醋酸（58∶42）；检测波长：430 nm；流速：1 mL·min－1；柱温：室温；进样量：20 μL。理论板数按姜黄素峰计算应不低于4000。精密量取姜黄素标准品5 mg和姜黄素温敏凝胶适量（含姜黄素约5 mg），分别置50 mL量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，按上述色谱条件分别进样。结果，姜黄素保留时间在7.7 min左右，分离度符合要求。色谱见图1。

2.2 姜黄素温敏凝胶的处方筛选

2.2.1 姜黄素温敏凝胶的制备[8，9]分别称取处方量P407、P188，加入60 mL磷酸盐缓冲液溶解，在4℃冰箱中放置至溶液澄明，为A液。精密称定处方量姜黄素，溶于处方量PEG400和1，2-丙二醇中，超声至完全溶解，为B液。将B液完全转移至A液中，所得溶液为C液，在C液中加入磷酸盐缓冲液至100 mL，在4℃放置至C液完全澄清，调节至所需pH值，即得（规格：2 mg·mL－1）。

2.2.2 胶凝温度的测定[10]采用搅拌子法，在西林瓶中装入温敏凝胶溶液10mL和搅拌子，插入精度为0.1℃的精密温度计，温度计的水银球完全浸没在凝胶溶液中。将其放入低温（10℃）水浴中，保持水浴持续缓慢升温，使凝胶的温度上升速率约为（1～2）℃·min－1。将磁力搅拌子完全停止转动的温度定义为胶凝温度。

2.2.3 黏度的测定[9]取凝胶样品溶液15 mL置样品管中，用循环水浴使其升温至40℃以上，再以（1～2）℃·min－1的速率缓慢冷却至10℃，选择合适量程的悬吊式转子测定不同温度下的黏度，从40℃开始，温度每下降1℃记录一个黏度值。

2.2.4 姜黄素的最大溶解度 精密量取不同配比的1，2-丙二醇、PEG400适量，置烧杯中，磷酸盐缓冲液加至100 mL，在超声溶解状态下，用减量法逐渐加入适量姜黄素至最大饱和为度（10～15 min内不再溶解为准），平行制备5个样品，按“2.1”项下色谱条件测定含量，求出平均值，结果见表1。

结果表明，姜黄素在10%PEG400、14%1，2-丙二醇中的溶解度最大，即（2.447±0.121）mg·mL－1，大大提高了姜黄素的溶解度。

表1 姜黄素的最大溶解度测定结果（±s，n＝5）Tab 1 Maximum dissolution rate of curcumin（±s，n＝5）

表1 姜黄素的最大溶解度测定结果（±s，n＝5）Tab 1 Maximum dissolution rate of curcumin（±s，n＝5）

PEG400/%6810810610861，2-丙二醇/%101214141012121410最大溶解度/mg·mL-11.605±0.1052.026±0.0032.447±0.1212.197±0.1182.105±0.0081.776±0.1072.276±0.1312.197±0.0061.605±0.145

2.2.5 含药量的测定 精密称取姜黄素标准品5 mg，置于25 mL量瓶中，甲醇稀释至刻度，得浓度为0.2 mg·mL－1的标准品贮备液，精密量取姜黄素标准品贮备液200、400、800、1600、3200、6400 μL，置于10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配成浓度分别为4、8、16、32、64、128μg·mL－1的系列标准溶液。按“2.1”项下色谱条件进样测定，平行测定3次，每次进样量20 μ L。以峰面积积分值（A）为纵坐标，姜黄素检测浓度（c）为横坐标，进行线性回归，得回归方程为A＝113.2 c+82.177（r＝0.9993）。精密量取200µL姜黄素温敏凝胶置10 mL量瓶中，甲醇定容。混匀后按上法测定，根据回归方程计算姜黄素温敏凝胶中姜黄素的含量。

2.2.6 正交试验优选处方 通过预试验中单因素试验结果，选择P407的浓度（A）、P188的浓度（B）、PEG 400的浓度（C）、1，2-丙二醇的浓度（D）为考察因素，以胶凝温度（T）、黏度（η）和含药量的综合评分为评价指标（评分方法：（1）T：由于人体的正常体温范围为36～37℃，故胶凝温度在此范围内者得100分，每低于36℃或高于37℃为1℃者扣5分，若转子无停止则记为0分。（2）η：以正交试验结果中胶凝温度时的黏度为标准，＜10 mPa·s者为100分，10～20 mPa·s者为90分，20～30 mPa·s者为80分，30～40 mPa·s者为70分。（3）含药量：以正交试验结果中含量最高者为满分100分，每低于此含量0.1 mg者扣5分。（4）综合评分：综合评分＝胶凝温度记分×50%+黏度记分×20%+含量记分×30%）。采用L9（34）正交表安排试验，测定评价指标，计算每次试验得分确定最佳配比，每个试验重复3次。用SPSS 11.5统计软件，多组资料采用方差分析，两组间比较采用t检验。因素水平见表2；正交试验结果见表3；方差分析结果见表4。

由表3、表4可知，4种因素对工艺均有显著性影响（P＜0.05或P＜0.01），其影响大小为A＞C＞D＞B，即P407浓度为影响姜黄素温敏凝胶性质的主要因素，其次是PEG400浓度，再次为1，2-丙二醇浓度，最后是P188浓度。较好的组合为A2B2C2D2，即P407浓度为20%、P188浓度为4%、PEG400的浓度为8%、1，2-丙二醇的浓度为12%。

2.3 姜黄素温敏凝胶最适宜pH值的确定

2.3.1 不同pH值下姜黄素温敏凝胶的标准曲线 配制pH值分别为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5的磷酸盐缓冲溶液，按“2.2.6”项下最终确定的处方量制备不同pH值的姜黄素温敏凝胶。待凝胶充分混匀溶解之后，用pH计调pH值为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，为不同pH值下的姜黄素的贮备液。精密量取各姜黄素贮备液0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mL，置于100 mL量瓶中，用甲醇定容，混匀后按“2.1”项下色谱条件测定，以峰面积积分值（A）为纵坐标，姜黄素检测浓度（c）为横坐标，制备各pH值下姜黄素的标准曲线，结果见表5。

表2 因素水平Tab 2 Factors and levels

表3 正交试验结果Tab 3 Results of orthogonal test

表4 方差分析结果Tab 4 Results of variance analysis

表5 不同pH值姜黄素温敏凝胶的标准曲线Tab 5 The standard curves of Curcumin thermosensitivehydrogels with different pH values

结果表明，在不同pH值的姜黄素温敏凝胶中姜黄素检测浓度在10～160 μg·mL－1范围内与峰面积积分值呈良好线性关系。

2.3.2 姜黄素降解速率的测定 将“2.3.1”项下制备的不同pH值下的姜黄素温敏凝胶置于4℃冰箱中，于1、2、3、4、6、10、14、20d时分别取200µL不同pH值的姜黄素温敏凝胶至10 mL量瓶中，用甲醇定容。混匀后按“2.1”项下色谱条件测定，根据标准曲线方程计算姜黄素浓度（c），以c（μg·mL－1）对时间t（d）作图，求不同pH值姜黄素温敏凝胶的降解速率常数（k）、半衰期（t1/2），结果见表6。

表6 不同pH值姜黄素温敏凝胶的降解方程及速率Tab 6 The degradation equations and degradation rates of Curcumin thermosensitive hydrogels with different pH values

结果表明，在4℃时，姜黄素温敏凝胶随时间的降解符合为零级动力学过程。不同pH值的姜黄素温敏凝胶的动力学方程、k、t1/2均不相同，随着pH值的升高，k加大。当pH值为6.0时，t1/2＝150.93 d，表明pH值为6.0时姜黄素温敏凝胶稳定，且稳定性明显优于姜黄素溶液（t1/2＝433.1h[5]），而当pH≥6时，姜黄素温敏凝胶的降解速率加快，故将姜黄素温敏凝胶的pH定为6.0。

综上所述，拟定姜黄素温敏凝胶的处方为0.2%姜黄素、20%P407、4%P188、12%1，2-丙二醇、8%PEG400、磷酸盐缓冲液加至100 mL，调pH值为6.0。

2.4 工艺验证试验

按上述最佳处方制备3批姜黄素温敏凝胶（批号：20110301、20110302、20110303），分别测定其T、在胶凝温度（36.5℃）时的η以及姜黄素的含量。结果，各指标分别为（36.5± 0.41）℃（n＝3）、（823± 6.23）mPa·s、（0.207±0.0021）%（即剂量为2.07 mg·mL－1），姜黄素温敏凝胶规格为2 mg·mL－1，所测姜黄素含量在常规含量限度范围内（1.8～2.2 mg·mL－1），含量符合规定。

3 讨论

药物辅料泊洛沙姆是由聚氧化乙烯与聚氧化丙烯组成的嵌段共聚物（PEO-PPO-PEO），由于聚氧乙烯链的相对亲水性和聚氧丙烯链的相对亲油性，使其具有表面活性，属于非离子型表面活性剂。多数泊洛沙姆在较高浓度时可以形成水凝胶，主要是由于分子间形成氢键的结果[11]。以P407为例，当其浓度高于15%时，可以形成凝胶。正交试验结果表明，随着P407浓度的增加，胶凝温度下降；与此相反，随着P188浓度的增加，胶凝温度则上升。加入溶剂1，2-丙二醇后，胶凝温度降低，黏度升高，主要是因为1，2-丙二醇也可以与泊洛沙姆形成分子间氢键，形成更大的分子。加入溶剂PEG400后，胶凝温度升高，黏度下降，PEG400的分子结构与泊洛沙姆相似，且水溶性优于泊洛沙姆，故使泊洛沙姆的水溶性降低，当PEG400浓度过高时则无法形成凝胶。试验证明，P407浓度若为18%，当PEG400的浓度大于15%时，不能形成凝胶，即无胶凝温度。本试验根据正交试验结果，筛选出了最佳处方，既有适宜的胶凝温度及黏度，又提高了姜黄素的含量，同时改善了姜黄素的稳定性，克服了其水溶性差的缺点，进而可提高姜黄素在体内的生物利用度，使其具有更大的开发和应用价值。

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