黄金牡丹合剂对内毒素血症小鼠细胞因子的影响

闻 凤，徐兴然，曾忠良，罗音久，赵爱珍，陈 超，林春蓉，张亚娟，赵 原（西南大学药学院，重庆 400715）

内毒素（LPS）血症是指革兰阴性菌侵入血液，并在其中大量繁殖、裂解后释放出大量LPS的病理过程，通常由感染、烧伤、烫伤等因素引发[1]，可表现为全身炎症反应综合征（SIRS）、感染性休克、缺血-再灌注损伤、弥散性血管内凝血（DIC）、多器官功能不全综合征（MODS）、多器官功能衰竭综合征（MOFS）等[2]，死亡率极高，目前尚无特效治疗措施。黄金牡丹合剂（HJM）是西南大学药学院的科研处方，主药为黄芩、金银花、牡丹皮经提取其有效部位制成的中药合剂，其中含有黄芩苷、绿原酸、丹皮酚等有效成分，具有清热解毒、抗炎、抗血栓和免疫调节作用。笔者通过ip自制大肠杆菌LPS复制小鼠LPS血症病理模型，用HJM干预，初步探讨该方对LPS血症小鼠的保护作用及其机制。

1 仪器与材料

1.1 仪器

ELX800型酶标仪（德国Invitek公司）；JY92-Ⅱ型超声细胞粉碎仪（宁波新芝生物科技有限公司）。

1.2 试药

HJM（西南大学药学院中医药教研室自制，批号：20100801，规格：1 g·mL－1）；地塞米松磷酸钠注射液（DEXA，西南药业股份有限公司，批号：110317，规格：1 mL∶5 mg）；白细胞介素（IL）-4、IL-6、肿瘤坏死因子（TNF）-α、ELISA试剂盒（美国RD公司）；水为无菌水。

1.3 动物和菌种

SPF级健康昆明种小鼠204只，体重（20±2）g，♀♂兼半；普通级新西兰兔2只，♂，体重（2.0±0.2）kg，均由第三军医大学实验动物中心提供（生产许可证SCXK（渝）2007-0003）。

O型大肠杆菌，由西南大学生物制药教研室提供。

2 方法

2.1 LPS的制备

取50 μL O型大肠杆菌（猪源致病性大肠杆菌菌株）加入到10 mL LB培养基中，37℃、120r·min－1振荡培养12 h，加入到含有50 mL兔全血的5000 mL新配制LB培养基中继续培养18 h，10000 r·min－1离心5 min收菌，生理盐水洗涤，加入适量生理盐水悬浮稀释，反复冻5次，超声细胞粉碎仪破壁，121℃高压灭菌20 min，分装备用，规格：5.02×1011cfu·mL－1。

2.2 小鼠72h死亡率测定

实验分为6组，即空白（等容无菌水6只）、模型对照（等容无菌水，16只）、DEXA（0.80 mL·kg－1，9只）和HJM高、中、低剂量（1.00、0.50、0.25mL·kg－1各16只）组。ip 2倍半数致死量（10 mL·kg－1）LPS复制LPS血症模型。复制模型0.5 h后各组ig相应药物，每天2次，连续3 d。观察临床症候，统计72 h死亡率，并剖检死亡小鼠观察病理变化。

2.3 细胞因子含量测定

实验分为4组，即空白（等容无菌水，5只）、模型对照（等容无菌水，40只）、DEXA（0.8 mL·kg－1，40只）、HJM（0.5 mL·kg－1，40只）组。按“2.1”项下方法复制模型。复制模型0.5 h后各组ig相应药物，每天2次，连续3d。分别于复制模型后6、12、18、24、48、72 h各组随机选取5只小鼠，摘眼球取血样，分离血清于－70℃贮藏，备用。血清中IL-4、IL-6、TNF-α含量测定采用ELISA法。

2.4 统计学方法

数据采用SPSS 17.0软件进行χ2检验（确切概率法），计数资料以±s 表示，多重比较用SNK法检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 临床症候、剖检结果与小鼠72h死亡率测定

小鼠临床症候表现：与空白组比较，模型对照组呼吸频率加快，精神不振，皮毛蓬松，眼目不睁且眼眵增加，便秘或腹泻，寒颤发抖，喜扎堆，运动减少；与模型对照组比较，HJM高、中、低剂量组临床症状显著改善。死亡小鼠剖检发现：与空白组比较，模型对照组小鼠皮下血管充血明显，四肢不同程度皮下出血，肠道、心、肝、肺、肾脏等多器官充血或出血，特别是肺、心和肝脏出血严重；与模型对照组比较，HJM高、中、低剂量组主要表现为小鼠背部皮下充血，脏器充血、出血减轻。

致病小鼠死亡时间主要集中在16～36h。模型对照组72 h死亡率为68.75%，HJM中剂量组死亡率为37.50%，比模型对照组降低31.25%（P＜0.01）；HJM高、低剂量组死亡率分别为62.50%、50.00%；空白组全部存活。72 h内各组小鼠死亡情况见图1。

图1 72h内各组小鼠死亡情况Fig 1 Deaths of mice within 72h

3.2 细胞因子含量测定

3.2.1 TNF-α含量测定 与空白组比较，模型对照组TNF-α含量显著升高（P＜0.01），在12 h达到峰值；与模型对照组比较，从18h HJM组TNF-α含量开始显著下降（P＜0.05）。血清中TNF-α含量测定结果见表1。

表1 血清中TNF-α含量测定结果（±s，n＝5）Tab 1 Effects of levels of TNF-α in serum（±s，n＝5）

表1 血清中TNF-α含量测定结果（±s，n＝5）Tab 1 Effects of levels of TNF-α in serum（±s，n＝5）

与空白组比较：＊P＜0.01；与模型对照组比较：#P＜0.05vs.blank group：＊P＜0.01；vs.model control group：#P＜0.05

组别空白组模型对照组DEXA组HJM组TNF-α含量/ng·L－16 h 204.92±9.62298.57±23.56＊260.08±15.31281.67±22.5012 h 204.92±9.62335.24±23.12＊282.50±17.86282.86±18.5618 h 204.92±9.62311.19±14.57＊270.95±17.22246.19±23.6#24 h 204.92±9.62308.69±17.64＊252.62±17.10280.71±20.7648 h 204.92±9.62292.62±17.60＊280.71±38.31267.92±24.4272 h 204.92±9.62291.24±25.25＊230.71±8.42#242.62±5.05

3.2.2 IL-4含量测定 与空白组比较，模型对照组IL-4含量随时间延长逐渐升高，在24h达到峰值，有显著性差异（P＜0.01）；与模型对照组比较，在48 h HJM组IL-4含量显著升高（P＜0.05）。血清中IL-4含量测定结果见表2。

表2 血清中IL-4含量测定结果（±s，n＝5）Tab 2 Effects of levels of IL-4in serum（±s，n＝5）

表2 血清中IL-4含量测定结果（±s，n＝5）Tab 2 Effects of levels of IL-4in serum（±s，n＝5）

与空白组比较：＊P＜0.01；与模型对照组比较：#P＜0.05vs.blank group：＊P＜0.01；vs.model control group：#P＜0.05

组别空白组模型对照组DEXA组HJM组IL-4含量/ng·L－16 h 50.68±2.5555.94±4.69＊61.30±2.2359.71±3.7112 h 50.68±2.5558.41±5.1260.94±6.8462.61±8.2518 h 50.68±2.5559.13±5.1267.25±9.8066.96±5.7424 h 50.68±2.5567.83±14.35＊71.21±4.8371.44±5.4748 h 50.68±2.5562.39±2.7463.12±7.9672.42±3.99#72 h 50.68±2.5558.99±4.3361.67±4.6068.55±2.05

3.2.3 IL-6含量测定 与空白组比较，模型对照组IL-6含量随时间延长显著升高（P＜0.01），在12 h达到峰值；与模型对照组比较，在12、18 h HJM组IL-6含量显著降低（P＜0.01）。血清中IL-6含量测定结果见表3。

表3 血清中IL-6含量测定结果（±s，n＝5）Tab 3 Effects of levels of IL-6in serum（±s，n＝5）

表3 血清中IL-6含量测定结果（±s，n＝5）Tab 3 Effects of levels of IL-6in serum（±s，n＝5）

与空白组比较：＊P＜0.01；与模型对照组比较：#P＜0.01vs.blank group：＊P＜0.01；vs.model control group：#P＜0.01

组别空白组模型对照组DEXA组HJM组IL-6含量/ng·L－16 h 41.53±1.7261.85±1.94＊53.63±2.0655.82±2.2912 h 41.53±1.7278.70±6.23＊68.29±4.91#65.79±2.26#18 h 41.53±1.7272.94±7.17＊60.31±2.76#61.30±2.44#24 h 41.53±1.7266.13±6.46＊60.62±3.6061.85±2.7848 h 41.53±1.7261.62±1.98＊55.14±2.0255.51±3.4272 h 41.53±1.7255.00±4.28＊50.20±0.9751.80±3.16

4 讨论

近来研究发现，败血症、内毒素血症、脓毒症、MODS等致死的主要原因不是细菌，而是LPS[3]。使用大肠杆菌LPS复制模型时，控制染毒剂量是关键，剂量过大，病理损害过强，药物治疗作用易被病理损害掩盖，易致假阴性结果，反之，易致假阳性结果。本次研究以小鼠死亡率控制在40%～70%的范围内确定LPS给予剂量。小鼠ip LPS后呈现明显的LPS血症病理过程，72 h模型对照组死亡率为68.75%，小鼠剖检可见多脏器损伤和炎症病理过程，血清中TNF-α、IL-4和IL-6含量持续升高，表明动物病理模型复制成功。

LPS进入机体后，激活白细胞产生TNF-α，它是炎症发生的重要起始因子，具有增强白细胞的趋化作用和吞噬作用[4]，增加血管壁通透性，释放溶酶体酶和氧自由基，促进IL-1、IL-6、IL-8等的释放，TNF-α浓度的高低与LPS血症病情一致[5]，本研究结果与万幸等[6]报道一致。有研究表明，IL-6能够促进激活的巨噬细胞分化和浸润，并上调某些细胞因子的表达，加剧炎性程度，并可介导肺损伤的急性期炎症反应[7]。本研究结果表明，IL-6含量在复制模型后6～12 h达到峰值，HJM组和DEX组IL-6含量在12h与模型对照组比较，显著下降。抗炎介质与促炎介质水平失衡是炎症发生并加重的重要因素[8]。IL-4为淋巴细胞（Th）2因子，具有抑制Th1的作用，是重要的抗炎介质。有研究表明，IL-4可显著抑制LPS介导单核细胞合成、释放促炎症介质，如TNF-α、IL-1和IL-6，且呈明显的量效关系，但IL-4产生比促炎介质释放晚，因而不能及时抑制炎症介质的释放，导致炎症反应放大。本研究结果表明，复制模型后HJM组IL-4含量升高，出现峰值时间比促炎因子TNF-α、IL-6要晚。

HJM方中以黄芩为君，清热燥湿、解毒，以治肺卫之热；银花为质轻气清鲜透之品，寓有“透热转气”之意，以助黄芩清解气分实热；丹皮清热凉血、活血散瘀化斑；水牛角清热凉血、清心除烦，诸药共用以求清热解毒、凉血散瘀之功。有研究表明，黄芩可作用于发热的多个病理环节，其解热效应与直接减少IL-1 β、TNF-α和IL-6含量有关[9]，也与调节细菌致病因子的表达和致病毒力有关，具有明显的抗炎、抗菌等作用；金银花是常治各种感染和炎症的中药之一，也具有解热、抗炎的功效[10]，对蛋清引起的局部急性炎症有明显的抑制作用[11]；牡丹皮具有抗菌、镇痛、抗炎、活血化瘀等作用[12]。基于此，该组方具有清热、解毒、抗炎、凉血、止血的功效是有实验基础的。

本研究证实，HJM通过降低TNF-α、IL-6含量，促进IL-4释放，减轻了小鼠LPS血症症状并降低死亡率。有关制剂的作用及其作用机制还有待进一步研究。

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