姜黄素对人神经母细胞瘤细胞作用的体外试验研究

秦怀洲，张治国，吴琳，王举磊，李立宏，高国栋#（.第四军医大学第二附属医院神经外科，西安70038；.第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室，西安 7003）

神经母细胞瘤是神经外科临床常见而难治的原发性肿瘤，目前其治疗主要应用手术切除再辅以常规放疗或化疗，患者预后情况普遍较差[1]。研究认为，以姜黄素为主要活性成分的姜黄，具有抗炎、抗氧化、抗HIV病毒等多种作用。已有研究表明，姜黄素对鼻咽癌[2]和宫颈癌[3]等多种肿瘤具有抑制作用。但目前姜黄素对抗神经系统肿瘤的作用及其机制研究较少，其对神经母细胞瘤的作用尚未见报道。笔者拟通过观察姜黄素促进神经母细胞瘤凋亡作用，进一步了解姜黄素对肿瘤细胞侵袭能力的影响，探讨其抗神经母细胞瘤的作用机制，并为多手段治疗该肿瘤打下基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器

BX260型荧光显微镜、CK30型倒置相差显微镜（日本Olympus公司）；Sunrise RC+TW型遥控酶标分析仪（奥地利Tecan公司）；FACSCalibur型流式细胞仪（美国BD公司），2406-2型CO2培养箱（美国Shellab公司）。

1.2 试药

姜黄素、MTT、顺铂、Annexin V/PI双标试剂盒、Hoechst33258试剂盒均购自美国Sigma公司；DMEM培养基（美国Gibco公司）；小牛血清（杭州四季青生物材料工程有限公司）；其余试剂均为国产分析纯。

1.3 细胞瘤

人神经母细胞瘤SH-SY5 Y细胞购自中国科学院上海细胞所。

2 方法

2.1 MTT法测定细胞存活率

取对数生长期的细胞，倾出其培养液，用PBS洗细胞3次，加适量的胰蛋白酶消化并细胞计数后，将细胞浓度调整至104个/mL。细胞悬液按每孔200 μL加入96孔培养板。姜黄素用75%的乙醇溶解配成母液，使用时用DMEM培养液稀释至所需浓度。将姜黄素设定6个浓度：1.25、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 μmol·L－1，即姜黄素①、②、③、④、⑤、⑥组；每种药物浓度接种5个复孔，每个浓度设阴性对照组（培养液中只有细胞，无药物）和空白对照组（培养液中只有等量的药物，无细胞）。细胞常规培养24 h后，将培养液换成含不同浓度药物的培养液，培养板置于CO2培养箱，37℃、50 mL·L－1CO2条件下继续培养48 h。然后取出全部培养板，每孔加入MTT溶液（5 g·L－1）20 μL，再继续培养4 h，小心吸出培养液，每孔加入150 μL二甲基亚砜，振荡10min，使沉淀充分溶解，用酶标仪在490 nm波长处测定吸光度，计算肿瘤细胞存活率：细胞存活率（%）＝（用药组吸光度值－空白对照组吸光度值）/（阴性对照组吸光度值－空白对照组吸光度值）×100%。

2.2 流式细胞仪分析细胞凋亡

根据Annexin V/PI双标试剂盒说明，用双蒸水1∶4稀释结合缓冲液，PBS洗涤样品细胞后，以稀释的结合缓冲液重悬细胞，并调整细胞浓度为（2～5）×105个/mL。姜黄素设定4个浓度：5.0、10.0、15.0、20.0μmol·L－1，即姜黄素①、②、③、④组。取195μL细胞悬液，加入5μL Annexin V混匀，室温反应10 min，PBS洗细胞1次，再以190 μL稀释的结合缓冲液重悬，加10 μL 20 μg·mL－1PI，用流式细胞仪分析，并计算凋亡细胞百分比。试验另设阳性对照（3 μg·mL－1顺铂）和阴性对照。

2.3 Hoechst33258荧光染料染色观察细胞核形态的改变

姜黄素设定4个浓度：5.0、10.0、15.0、20.0 μmol·L－1，即姜黄素①、②、③、④组。药物处理后的细胞用PBS洗涤并重悬，加入浓度为5 μg·mL－1的Hoechst33258荧光染料反应10 min，于荧光显微镜下观察。观察细胞核形态，以细胞萎缩、核固缩、染色质凝聚和荧光强度增强等作为凋亡细胞指征。试验另设阳性对照（3 μg·mL－1顺铂）和阴性对照。

2.4 SH-SY5Y细胞体外侵袭能力的测定

Transwell小室为一杯状结构，杯孔直径6.5mm；杯底由8.0 μm孔径的聚碳酸脂微孔滤膜封闭。滤膜内表面均匀涂人工重构基底膜材料基质胶约50 mg·L－1，包被后水化基底膜。将制备好的小室4℃风干，用紫外线照射2 h杀菌，使用前加入少量无血清的培养基水化。各组分别处理SH-SY5 Y细胞后，小室内加入100 μL肿瘤细胞悬液，细胞密度为105 mL，培养液为含10 g·L－1的BSA无血清培养液，Transwell小室加入500 μL含胎牛血清培养液。培养12 h后取出滤膜，PBS液淋洗，用棉签擦去滤膜上层的细胞，95%酒精固定，4 g·L－1结晶紫溶液染色。计数穿膜细胞数，取每个视野的平均数表示肿瘤细胞的侵袭能力。试验设阳性对照（3 μg·mL－1顺铂）和阴性对照。

2.5 统计学方法

3 结果

3.1 姜黄素对SH-SY5Y细胞生长的抑制作用

MTT试验检测细胞存活率（重复3次试验得到相似的结果），并绘制细胞生存曲线。结果表明，姜黄素能抑制SH-SY5 Y 细胞的生长，且半数抑制浓度（IC50）为 15 μmol·L－1。姜黄素对SH-SY5 Y细胞生长的抑制作用见图1。

图1 姜黄素对SH-SY5Y细胞生长的抑制作用Fig 1 Inhibition effect of curcumin on the growth of SH-SY5Y

3.2 姜黄素对SH-SY5Y细胞凋亡的影响

由流式细胞仪分析结果可知，姜黄素各浓度组均出现了明显的亚二倍体凋亡峰，各组的凋亡细胞百分比与阴性对照比较，有显著性差异（P＜0.01）。不同浓度姜黄素对SH-SY5 Y细胞凋亡的影响见表1。

3.3 姜黄素对细胞形态学的影响

随着药物浓度的增加，与阴性对照组比较，姜黄素各组中SH-SY5 Y细胞数量逐渐减少。姜黄素处理48h后，经Hoechst33258荧光染料染色，可见具有凋亡征象的肿瘤细胞，细胞变圆、变小、收缩，胞核深染、固缩，细胞质也出现收缩现象。正常细胞则细胞膜完整、光滑，细胞核正常。

表1 不同浓度姜黄素对SH-SY5Y细胞凋亡的影响（±s）Tab 1 Effects of different concentrations of curcumin on the apoptosis of SH-SY5Y（±s）

表1 不同浓度姜黄素对SH-SY5Y细胞凋亡的影响（±s）Tab 1 Effects of different concentrations of curcumin on the apoptosis of SH-SY5Y（±s）

与阴性对照组比较：＊P＜0.01vs.negative control group：＊P＜0.01

组别阴性对照组阳性对照组姜黄素①组姜黄素②组姜黄素③组姜黄素④组浓度/μmol·L－1- - 5101520 n 333333凋亡细胞百分比5.22±1.6862.63±5.21＊16.87±4.25＊29.90±2.95＊45.77±5.65＊61.53±4.91＊

3.4 姜黄素对SH-SY5Y细胞侵袭能力的影响

阴性对照组细胞均能够穿过铺有人工重构基底膜材料的基质胶，姜黄素各组穿膜细胞数均少于阴性对照组（P＜0.01），且随姜黄素浓度升高，穿膜细胞数明显减少。姜黄素④组与阳性对照组比较，穿膜细胞数无显著性差异。不同浓度姜黄素对SH-SY5 Y细胞穿膜数量的影响见表2。

4 讨论

本试验以SH-SY5 Y细胞为研究对象，结果随着剂量的增加，细胞生存率显著降低，SH-SY5 Y细胞的生存曲线显示其生长明显受到抑制，说明姜黄素能明显抑制该肿瘤细胞生长。Hoechst33258荧光染色结果也表明，姜黄素可促进SH-SY5 Y细胞的凋亡，并使细胞出现形态学改变。Transwell细胞侵袭能力试验发现，随着姜黄素作用浓度的增加，肿瘤细胞的侵袭能力逐渐下降，这与近期国外一项研究显示的姜黄素能降低结肠癌的侵袭能力一致[4]。提示姜黄素具有减少神经母细胞瘤转移复发的作用。这些数据可为姜黄素治疗神经母细胞瘤提供依据，也可为多途径综合治疗神经母细胞瘤提供策略，但其具体作用机制还需进一步研究。

表2 不同浓度姜黄素对SH-SY5Y细胞穿膜数量的影响（±s）Tab 2 Effects of different concentrations of curcumin on the number of passed membrane SH-SY5Y（±s）

表2 不同浓度姜黄素对SH-SY5Y细胞穿膜数量的影响（±s）Tab 2 Effects of different concentrations of curcumin on the number of passed membrane SH-SY5Y（±s）

与阴性对照组比较：＊P＜0.01vs.negative control group：＊P＜0.01

组别阴性对照组阳性对照组姜黄素①组姜黄素②组姜黄素③组姜黄素④组浓度/μmol·L－1--5101520 n 333333穿膜细胞数（个/孔）197.0±9.862.7±6.8＊164.3±12.1＊133.7±4.2＊100.0±10.5＊64.7±7.8＊

[1]Saulnier SG，Bergendahl GM，Brard L，et al.Aphase 1 study of nifurtimox in patients with relapsed/refractory neuroblastoma[J].J Pediatr Hematol Oncol，2011，33（1）：25.

[2]Wong TS，Chan WS，Li CH，et al.Curcumin alters the migratory phenotype of nasopharyngeal carcinoma cells through up-regulation of E-cadherin[J].Anticancer Res，2010，30（7）：2851.

[3]Singh M，Singh N.Curcumin counteracts the proliferative effect of estradiol and induces apoptosis in cervical cancer cells[J].Mol Cell Biochem，2011，347（1-2）：1.

[4]Nautiyal J，Banerjee S，Kanwar SS，et al.Curcumin enhances dasatinib-induced inhibition of growth and transformation of colon cancer cells.[J].Int J Cancer，2011，128（4）：951.