5-Aza-2′-dC通过上调DR4与DR5表达增加TRAIL诱导乳腺癌细胞凋亡的敏感性

仇凤启，赵丹，孙大鹏，刘新莉，李晓曦，马萍

（中国医科大学附属第一医院肿瘤研究所二室，沈阳110001）

乳腺癌是女性常见恶性肿瘤之一。西方国家女性乳腺癌发病率居女性肿瘤的首位，死亡率高达22.8%［1］。随着肿瘤分子机制研究的深入，分子靶点治疗成为乳腺癌治疗的重要手段。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）是肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）家族成员之一，能通过细胞外途径和线粒体依赖的细胞内途径诱导细胞凋亡。5-Aza-2′-dC是DNA甲基化转移酶抑制剂，能有效逆转基因甲基化［2］，重建基因的表达和功能。本研究利用5-Aza-2′-dC预处理乳腺癌 MDA-MB-231细胞，观察TRAIL诱导细胞凋亡敏感性的变化，并进一步探讨其可能的机制，为进一步研究如何增强TRAIL抗乳腺癌作用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

乳腺癌MDA-MB-231细胞购自中国医学科学院上海细胞研究所，细胞用含10%胎牛血清的L-15培养基，37℃、无CO2条件下培养。鼠抗人FITC荧光标记DR4和DR5单克隆抗体购自美国BD公司，鼠抗人caspase-8单克隆抗体购自美国cell-signaling公司，HRP标记山羊抗鼠抗体购自康为世纪公司，RT-PCR引物及RT-PCR试剂盒均购自TaKaRa公司，Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自南京凯基公司，MTT购自美国Biosharp公司。5-Aza-2′-dC购自美国Santa Cruz公司。

1.2 MTT法检测细胞增殖抑制率

取对数期生长细胞，接种于96孔板，细胞贴壁后，弃上清更换培养基，随机将细胞分为5-Aza-2′-dC 预处理组和对照组。5-Aza-2′-dC（5 μmol/L）预处理细胞 96 h，TRAIL（0，50，100，200 ng/mL）处理细胞12 h。然后，每孔加入5 μg/mL MTT20 μL，继续培养4 h。吸去培养液，每孔加入DMSO150 μL，振荡10 min，室温静置20 min，酶标仪检测490 nm处光密度值。

1.3 Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡

取对数期生长细胞，细胞分组及处理同1.2。收集、洗涤处理后细胞，按照Annexin V-FITC/PI说明书进行操作。所有样本避光，1 h内用流式细胞仪检测。

1.4 流式细胞仪检测细胞表面DR4和DR5蛋白的表达

取对数生长期细胞，5-Aza-2′-dC（终浓度5 μmol/L）处理细胞96 h，同时设对照组。PBS洗2次，调整细胞浓度为1×106/mL，取100 μL细胞悬液，分别加入 Isotype抗体10 μL及 FITC标记的 DR4、DR5抗体20 μL，避光孵育20 min。冷PBS洗细胞1次，将细胞重悬于500 μL PBS中，流式细胞仪检测细胞表面DR4和DR5蛋白的表达。

1.5 Western blot检测caspase-8蛋白表达水平

取对数生长期细胞，5-Aza-2′-dC（终浓度5 μmol/L）处理细胞96 h，同时设对照组。收集细胞，用RIPA强裂解液提取各组细胞总蛋白，BCA法检测蛋白浓度。蛋白上样，琼脂糖凝胶电泳及转膜，TBST配制5%脱脂牛奶封闭2 h，用caspase-8一抗+5%脱脂牛奶4℃孵育过夜，TBST缓冲液洗膜3次，辣根过氧化物酶标记二抗+5%脱脂牛奶室温孵育2 h。ECL法发光显色。

1.6 Real-time PCR 检 测 DR4、DR5和 caspase-8 mRNA的表达

取对数生长期细胞，5-Aza-2′-dC（终浓度5 μmol/L）处理细胞96 h，同时设对照组。收集细胞，RNAiso Plus提取细胞总RNA。逆转录获取cDNA。反应条件：95℃预变性30 s，进入反应循环，95℃5 s，60℃30 s，40个循环，于60℃收集荧光信号。结果用ΔΔCt法分析。引物由TaKaRa公司设计，序列如 下 ：DR4：Forward：GGAACACAGCATGTCAGTG －CAA，Reverse：TGTCACTCCAGGGCGTACAATC；DR5：Forward：AGCTAAGTCCCTGCACCACGA，Reverse：TGT ACAATCACCGACCTTGACCA；Caspase-8：Forward：CCAAATGCAAACTGGATGATGAC，Reverse：CTCTTG TTGATTTGGGCACAGAC。

1.7 统计学分析

每组实验均重复3次。采用SPSS15.0统计软件进行数据分析，实验数据以s表示，组间分析采用单因素方差分析和t检验，检验标准α=0.05。

2 结果

2.1 5-Aza-2′-dC增加TRAIL抑制MDA-MB-231细胞增殖的敏感性

结果表明：5-Aza-2′-dC预处理组增殖抑制率为（3.13±0.14）%，（15.77±0.55）%，（56.15±1.31）%和（69.10±1.34）%，对照组增殖抑制率为（2.73±0.09）%，（11.52±0.91）%，（41.59±1.41）%和（60.48±0.69）%，组内及组间比较均有统计学差异（P<0.01）（图1）。结果提示：TRAIL对乳腺癌细胞增殖抑制率呈剂量依赖性，5-Aza-2′-dC能增加TRAIL抑制乳腺癌细胞增殖的敏感性。

2.2 5-Aza-2′-dC增加TRAIL诱导MDA-MB-231细胞凋亡的敏感性

按照实验分组处理细胞，预处理组凋亡率分别为（3.58±0.28）%，（20.69±0.24）%，（54.32±0.45）%和（80.30±1.83）%，对照组凋亡率分别为（3.44±0.27）%，（16.06±0.15）%，（43.44±0.79）%和（73.99±2.54）%，组间及组内比较差异均有统计学意义（P<0.01）（图2）。提示 TRAIL诱导 MDA-MB-231细胞凋亡，呈浓度依赖性，5-Aza-2′-dC能增加TRAIL诱导细胞凋亡的敏感性。

2.3 5-Aza-2′-dC 增加 DR4、DR5和 caspase-8表达

流式细胞仪检测结果表明：5-Aza-2′-dC预处理组DR4表达（83.83%）明显高于对照组（4.64%）（图3A、3B）。预处理组DR5表达（88.10%）明显高于对照组（10.10%）（图3 C、3D）。Western blot结果显示：5-Aza-2′-dC预处理细胞96 h后，MDA-MB-231细胞caspase-8表达增加，同时能诱导caspase-8蛋白的活化（图3E）。

2.4 5-Aza-2′-dC 增加 DR4、DR5 和 caspase-8mRNA表达

Real-time PCR结果显示：5-Aza-2′-dC预处理细胞96 h后，DR4、DR5和caspase-8mRNA表达增加，表明5-Aza-2′-dC可能在基因水平增加了凋亡通路相关蛋白的表达。

3 讨论

TRAIL作为TNF家族成员之一，能与肿瘤细胞表面受体结合选择性诱导肿瘤细胞凋亡，而不影响正常组织细胞，是很有前景的抗肿瘤因子之一。TRAIL受体包括功能性受体DR4/DR5，诱骗受体DcR1/2和OPG［3］。TRAIL与受体结合诱导Fas相关死亡结构域形成，进一步结合precaspase-8，形成死亡诱导信号复合物，通过蛋白剪切作用，形成活化的caspase-8，激活下游通路相关因子，诱导细胞凋亡［4］。

虽然TRAIL抗肿瘤作用有特异性优势，但是很多肿瘤细胞对TRAIL诱导的凋亡有抵抗作用，这成为TRAIL发挥抗肿瘤作用的主要障碍。肿瘤细胞对TRAIL产生抵抗与受体和凋亡通路相关因子的表达水平密切相关，通过TRAIL与其他药物联合可增加 TRAIL 抗肿瘤敏感性［5］。Horak 等［6］发现，在子宫癌中由于表观遗传学作用导致DR4表达缺失，是子宫癌对TRAIL抵抗的机制之一。在乳腺癌中存在DR4/DR5基因甲基化，这种基因突变导致的DR4/DR5表达的降低，也是乳腺癌细胞对TRAIL诱导凋亡抵抗的原因［7］。Geelen 等［8］的研究结果表明，结肠癌中caspase-8表达降低是肿瘤细胞对TRAIL抵抗的重要原因，通过上调caspase-8的表达能重建结肠癌细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感性。本研究结果也表明，通过5-Aza-2′-dC预处理能促进乳腺癌细胞内caspase-8表达，增强了TRAIL诱导乳腺癌细胞凋亡的作用。

多项研究表明，可以通过多种途径增加TRAIL诱导乳腺癌细胞凋亡敏感性。Kisim等［9］通过AT-101促进乳腺癌细胞DR4和DR5的表达，促进了乳腺癌细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感性，Ding等［10］的研究结果同样表明，DR4表达增加及c-FLIP表达的降低能促进TRAIL诱导乳腺癌细胞凋亡的敏感性。本研究结果表明，通过5-Aza-2′-dC处理细胞能明显增加DR4和DR5的表达，这种上调作用发生在mRNA水平，最终增加了乳腺癌细胞对TRAIL诱导凋亡作用的敏感性。这种上调可能是由于5-Aza-2′-dC抑制了相关基因表观修饰的甲基化作用，但其具体机制尚需进一步探讨。

综上所述，本研究通过5-Aza-2′-dC作用乳腺癌细胞，增加了TRAIL诱导乳腺癌细胞凋亡的敏感性，这种作用可能与DR4、DR5和caspase-8的表达上调有关。但是TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡通路机制复杂，尚需进一步探讨。

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