基于肾主骨理论观察肾小球系膜细＊胞对成骨细胞增殖及功能的影响

吴 锋，林日阳，何立群

(上海中医药大学附属曙光医院肾内科、肝肾疾病病证教育部重点实验室、上海市高校中医内科E-研究院，上海 200021)

中医藏象理论认为“肾藏精，主骨生髓”。目前临床上多用补肾中药治疗骨质疏松等骨代谢疾病，补肾中药可通过多环节、多途径调节骨形成与骨吸收［1］。现代医学从肾脏对钙磷及激素内分泌的角度来阐释中医的肾主骨理论。肾主骨理论的实验研究动物模型，是用人为方法复制肾损伤或骨损伤的动物模型，然后从组织学、病理学、形态计量学、生物力学、分子生物学等角度观察骨或肾的变化，以此来寻找肾损及骨和骨损及肾的客观依据［2］。“肾主骨”的理论体系研究中还缺少应用体外直接客观的实验方法。肾小球系膜细胞是肾小球的主要固有细胞之一，成骨细胞是骨的主要功能细胞，我们根据中医“肾主骨”的理论，应用体外细胞培养技术，避免体内复杂的影响因素，首次将肾脏的主要功能细胞-肾小球系膜细胞直接作用于骨的主要功能细胞-成骨细胞，在细胞水平观察两者的内在联系，为进一步研究和证实中医“肾主骨”理论提供更直接及客观确切的现代科学实验基础，为中医理论的客观化研究和临床研发补肾中药防治骨及骨关节疾病提供新的实验方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 新生(出生24 h以内)红皮 SD大鼠和100g SD雄性大鼠，由上海中医药大学实验动物中心提供。

1.1.2 主要实验试剂 RPMI-1640基础培养液(GIBCO)、碱性磷酸酶(ALP)及骨桥蛋白(OPN)检测试剂(Biotnt公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞提取分离 (1)肾小球系膜细胞提取分离:在无菌条件下分离SD雄性大鼠肾脏，采用系列筛网法分离肾小球，取上清液经0.1%IV型胶原酶消化后，加入RPMI-1640基础培养液制成悬液，使肾小球悬液均匀种植在瓶底。将培养瓶置入37℃5%CO2的孵箱中培养。3周后传代，选择第3～5代系膜细胞用于实验。采用免疫荧光法进行鉴定，抗结蛋白抗体阳性、抗细胞角蛋白抗体阴性证实为系膜细胞;(2)成骨细胞提取分离:取新生SD大鼠颅盖骨剪碎，经胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶振荡，收集上清液离心，吸弃上清液。加入RPMI-1640基础培养液，制成细胞悬液，采用反复贴壁法纯化，接种于25cm2培养瓶中，置入5%CO237℃培养箱培养。细胞汇合达80%左右培养瓶底，即进行传代。本实验均采用3～5代细胞。细胞鉴定:显微镜下见细胞贴壁生长呈三角形、纺锤形和多角形等多种形态，行碱性磷酸酶染色，倒置相差显微镜下观察细胞的细胞核及细胞质上形成的灰黑至深黑色颗粒状或片状沉淀。

1.2.2 成骨细胞的分组培养 取成骨细胞以5×104个/ml，100ul/孔接种于96孔培养板内，细胞贴壁后更换含0.5%FBS的RPMI-1640培养液培养12 h，然后分成正常血清组和系膜细胞组2组，给予2种不同培养液，每组8孔，隔天换液1次。

1.2.3 培养液的制备 (1)正常血清组培养液:SD雄性大鼠用3%戊巴比妥腹腔注射麻醉后，腹主动脉取血、离心(3000r/min，20 min)并收集上清液，－20℃冷藏，使用前4℃冰箱解冻过夜，56℃水浴灭活20min过滤除菌，用RPMI-1640培养液稀释至10%;(2)系膜细胞组培养液:取系膜细胞均匀接种于25cm2培养瓶中，至细胞铺占瓶底约80%。换用含10%的正常小鼠血清RPMI-1640培养液，10ml/瓶，继续培养，3d后吸取上清液备用。使用时用正常血清组培养液稀释至20%。

1.2.4 成骨细胞增殖检测(MTT法)各组分别在培养 24h、48h、72h、120h 后，加入 20μl新鲜配制过滤除菌的MTT(5mg/ml)，继续培养4 h后弃去培养液，倒置 96孔板于吸水纸上，加入 100μl DMSO，振荡孵育 10min，在酶标仪上检测光密度(OD)值，检测波长490 nm，每组8孔。

1.2.5 成骨细胞上清液ALP及OPN浓度的检测 各组在培养72h后吸取培养液，ELISA法检测ALP及OPN浓度，步骤严格按照说明书，每组5孔。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 成骨细胞增殖的情况

表1显示，系膜细胞组和正常血清组的成骨细胞都随着时间而逐步增殖。在正常血清组，后3个时间点与培养 24h相比，分别增长了 40.7%、66.8%、322.8%。在系膜细胞组后3个时间点与培养 24h 相比，分别增长了 24.1% 、54.7% 、176.1% 。但系膜细胞组在各时间点的增殖要明显快于正常血清组(P＜0.05)，系膜细胞组比正常血清组各时间点分别高 72.4% 、52.1% 、60.0% 、12.6% ，说明肾系膜细胞培养上清液能作用于成骨细胞，促进成骨细胞的增殖。

表1 成骨细胞增殖的OD值(n=8，±s)

表1 成骨细胞增殖的OD值(n=8，±s)

注:与正常血清组比较:*P＜0.05

24h 48h 72h 120h正常血清组 0.337 ±0.038 0.474 ±0.067 0.562 ±0.053 1.425 ±组 别0.151系膜细胞组 0.581 ±0.064* 0.721 ±0.202* 0.899 ±0.149* 1.604 ±0.040*

2.2 成骨细胞上清液ALP及OPN浓度的情况

表2显示，在第3天系膜细胞组的ALP浓度高于正常血清组30.5%，要明显高于正常血清组(P＜0.05)。系膜细胞组的 OPN浓度高于正常血清组55.0%，说明肾系膜细胞培养上清液能作用于成骨细胞，促进成骨细胞分泌ALP及OPN。

表2 第3天成骨细胞上清液ALP及OPN的浓度(n=5，±s)

表2 第3天成骨细胞上清液ALP及OPN的浓度(n=5，±s)

注:与正常血清组比较:*P＜0.05

组 别 ALP(μg/L)OPN(μg/L)正常血清组13.72 ±10.16 2.840 ±0.476 8.85 ± 8.85系膜细胞组 3.707 ±0.294*

图1 各时间点成骨细胞增殖情况

3 讨论

《医经精义》中记载:“肾藏精，精生髓，髓生骨，故骨者，肾之所合也。髓者，肾精所生，精足则髓足，髓在骨内，髓足者骨强。”《素问·逆调论》曰:“肾者水也，而生于骨，肾不生，则髓不能满，故寒甚至骨也，所以不能冻栗者……病名曰骨痹，是人当挛节也。”中医从生理及病理上都对“肾”与“骨”的密切联系作了详尽阐述。在治疗学上，《圣济总录·诸痹门》中强调以补肾填精为君药治疗骨痹。对中医“肾主骨”理论可以从两个方面理解:一是解剖学意义上的肾脏对骨代谢的影响，其实质主要指肾脏1-α羟化酶的活性及肾脏对钙磷代谢的调控;二是中医学综合意义上的肾对骨代谢的复杂调控网络，既包括对下丘脑-垂体-靶腺轴不同环节、不同层面功能的概括，也包括骨骼组织局部微环境各种调节因子的功能［3］。

中医“肾主骨”理论中的“肾”虽与现代解剖学上的肾脏并不完全等同，但肾脏是“肾主骨”理论体系中最主要的器官。肾脏与骨皆发生于胚胎外胚层，是同源器官，在发生学上有着相关性。目前对“肾主骨”的现代科学研究中，肾脏对骨代谢的影响主要是从肾脏对1-α羟化酶的活性及对钙磷代谢的调控方面。近年来的研究表明，Wnt/β-Catenin-BMP信号途径在调节肾脏发育、功能活动和骨代谢中具有重要的作用［4、5］。但目前的现代科学研究方法都未将肾脏与骨直接相联系。

肾小球系膜细胞是肾小球的主要固有细胞之一，具有分泌多种生物活性物质的功能。成骨细胞来源于骨髓间充质干细胞，是骨形成过程中的重要功能细胞，其主要功能是分泌骨基质，不仅与骨的形成密切相关，而且在骨吸收过程中也起关键性作用。成骨细胞对骨组织的生长发育、骨代谢平衡、骨量维持和损伤修复起关键作用。本实验首次应用体外细胞培养技术，排除了体内多种因素的相互影响，将肾小球系膜细胞直接作用于成骨细胞，在细胞水平直接观察两者的内在联系，为“肾主骨”提供更直接及客观的现代科学实验方法。

实验结果表明，肾系膜细胞能直接促进成骨细胞的增殖及功能。系膜细胞组在各时间点要比正常血清组的成骨细胞增殖程度都明显增加。ALP是成骨细胞所分泌的一种酶蛋白，与成骨细胞的分化有密切关系，是成骨细胞早期分化的标志物，其活性的明显升高是成骨细胞成熟的一大特征，也是评价机体成骨活性的特异性指标［6］。我们参照文献［7］，在成骨细胞培养第3天时检测ALP浓度。结果表明，在第3天时系膜细胞组上清液的ALP浓度比正常血清组明显增高。OPN是一种硫基化和磷酸化的糖蛋白，是骨组织中的主要非胶原蛋白。OPN在成骨细胞中广泛存在，不同成熟阶段的成骨细胞均能合成和分泌OPN，是成骨细胞的表型之一。结果表明，在第3天时系膜细胞组上清液的OPN浓度比正常血清组增高55.0%，说明肾小球的主要固有细胞可以直接促进骨形成，调节骨代谢。通过检测肾小球系膜细胞分泌的上清液对成骨细胞增殖及功能的影响，为进一步研究中医“肾主骨”理论现代科学基础提供新思路、新途径。

［1］王拥军，卞 琴，崔学军，等.“肾主骨”理论研究的思路与方法［J］.上海中医药大学学报，2010，24(1):8-12.

［2］王善金.肾主骨理论的现代研究概况［J］.光明中医，2006，21(2):54-55.

［3］孔月晴.肾主骨、肾与骨代谢内涵探讨［J］.光明中医，2010，25(3):353-354.

［4］Lyons JP，Miller RK，Zhou X，et al.Requirement of Wnt/beta-Catenin signaling in pronephric kidney development［J］.Mech Dev，2009，126(34):142-159.

［5］Kazama I，Mahoney Z，Miner JH，et al.Podocyte-derived BMP7 is critical for nephron development［J］.J Am Soc Nephrol，2008，19(11):2181-2191.

［6］李玉彬，谢利民，李 敏，等.健脾补肾方含药血清对体外培养的兔骨髓间充质干细胞定向分化的影响［J］.中国中医骨伤科杂志，2010，18(5):13-15.

［7］沈祥春，杨如会，彭 佼，等.健骨固本胶囊含药血清对大鼠成骨细胞作用的实验研究［J］.中华中医药杂志，2010，25(2):278-281.