海洋生物活性药物对细胞周期与凋亡的调控在抗肿瘤治疗中的作用

齐相薇，张湘宁，黄培春

作为生命的发源地，海洋具有丰富的生物多样性。多数无脊椎动物（如贝类和海绵类）不具有天然抵抗力，即内在免疫系统，需要合成具有生物学活性的次级代谢产物以获得相应的功能。这些代谢产物在保护宿主的生存和适应极端环境方面起着重要的作用，也是近年来药物研发的热点。由海洋生物提取、制备的抗癌药物作用于恶性细胞的标志性特征被归纳为：①易于对生长信号满足；②对拮抗生长的信号产生的效应不敏感；③对细胞凋亡机制的逃避；④不受限制的增殖能力；⑤持续的新生血管生成；⑥具有浸润与转移的能力[1]。

本文拟从药物对细胞周期的调控作用和对细胞凋亡的诱导与增强作用两方面讨论目前已开发的海洋生物药物的抗癌活性，并对正处于研发阶段的药物可能的抗肿瘤机制进行探讨。

1 对细胞周期的调控作用

细胞周期是一个被紧密控制和协调组织的过程，调控着细胞的生存，该过程的紊乱，可导致细胞周期阻滞和细胞死亡。细胞周期由一个时相进展到下一时相，受到检查点的控制，DNA 损伤的刺激，激活 p53 的表达，作用于检查点机制，启动周期阻滞、DNA 修复和细胞凋亡[2]。

癌细胞对负性生长调控与抗增殖信号的逃避在恶性增殖中起着重要的作用。pRb 蛋白功能的丧失，影响到抗增殖信号的发放，使癌细胞不再受到负性的调控。突变和组成性磷酸化都可以造成 Rb 调控环路的失活。Rb 的非磷酸化或低磷酸化都能抑制细胞周期的进展和细胞生长。细胞在活跃增殖的过程中，周期蛋白使 Rb 高磷酸化能有效去除这种阻遏作用。使 Rb 蛋白质组成型磷酸化的药物，在癌细胞中能有效地重建受控的生长与增殖。

源于海洋的天然花柏烷型倍半萜 dactylone 与某些可食赤藻的次级代谢物具有结构和功能的相似性。研究结果表明，dactylone 及结构类似的化合物能减少恶性细胞转化和增殖[3]。该药物在非毒性剂量时可有效预防肿瘤的发生，其机制是通过抑制 cyclin D3、细胞周期依赖性激酶 4（cyclin-dependent kinase，CDK4）的表达和 Rb 的磷酸化从而阻滞肿瘤细胞由 G1期进展到 S 期，并诱导细胞发生凋亡。近年来，通过对海绵类海洋生物的研究证实，其活性成分通过作用于细胞周期的不同环节发挥抗肿瘤作用。Petrosia sp.海绵中分离到的聚乙炔醇 dideoxypetrosynol A可通过诱导 CDK 的抑制物 p16，并下调 pRb 的磷酸化，抑制人类单核细胞白血病细胞系 U937 的生长[4]。来自海绵mycalehentscheli 的化合物 peloruside 可抑制 Ha-ras 转化的细胞生长，并诱导其发生细胞凋亡，并将发生肿瘤基因转化的细胞阻滞于 G2/M 期。软海绵素类（halichondrin）能抑制微管蛋白的多聚化，在对人肺腺癌 A549 细胞增殖抑制实验中，该化合物通过上调生长阻滞与 DNA 损伤诱导蛋白 45（growth arrest and DNA 45 damage-inducible protein 45，GADD45），并下调 c-Myc 蛋白的水平将细胞周期阻滞于 G2/M 期[5-6]。Agelas 属的海绵 axinella sp.和繁茂膜海绵均富含溴化吡咯类生物碱。据报道，这类化合物都具有抗肿瘤的活性。Xiong 等[7]分离了一种新型的溴化吡咯生物碱—— N-(4,5-二溴-吡咯-2-羰基)-L胺基异戊酸甲酯（B6）。B6 能在体外抑制各种肿瘤细胞的增殖，其中对 LOVO 和HeLa 最为明显。在小鼠移植瘤模型中，也有明显的生长抑制作用。B6 处理的细胞被阻滞于 G1期，并发生细胞凋亡。B6 还能促进 Ca2+的释放，而胞内 Ca2+浓度升高与细胞凋亡相关。

E7974 是一种海绵天然产物哈米特林的人工合成类似物，针对微管蛋白的抗有丝分裂机制发挥药物活性，对纯化微管蛋白多聚化的抑制强度与长春新碱相当，在培养细胞中，可诱导 G2/M 期阻滞，类似于靶向微管蛋白的抗癌药物，可明显干扰有丝分裂时纺锤丝的合成。组织细胞淋巴瘤U937 细胞经 E7974 处理后，大量亚二倍体细胞出现，提示 G2/M 期阻滞后，细胞凋亡启动。E7974 短暂作用就可诱导大量的有丝分裂阻滞，提示即使血药浓度下降之后，其仍然能够发挥抗癌活性[8]。

人类染色体 3 短臂的一个在肿瘤组织经常丢失的区域3p21 上聚集着多个候选抑癌基因，其中的 BLU/ZMYND10在鼻咽癌组织和培养细胞中因启动子甲基化表达沉默。根据我们待发表的实验结果，BLU 基因在鼻咽癌细胞重建表达时，该基因的表达产物通过调控 JNK 活性下调 cyclin D1活性，阻滞靶细胞的周期运行。用海洋生物虾蛄的提取物处理肿瘤细胞可观察到细胞周期阻滞。处理的细胞收获后，以流式细胞仪分析 DNA 含量，结果提示细胞周期阻滞在 S期，且 S 期细胞数的改变为药物浓度依赖式。细胞周期阻滞伴有增殖期胞核抗原（PCNA）增高，PCNA 的改变也表现为药物浓度依赖式。

2 对细胞凋亡的调控作用

肿瘤细胞通过不同的机制获得对细胞凋亡的抗性，这些机制包括抑癌基因 p53 的突变灭活。海洋药物对PI3K/AKT/PKB 抗凋亡活性具有明显的抑制作用，一些药物还能增强 Fas 死亡信号。

胱天蛋白酶（caspase）依赖的细胞凋亡通路，是许多抗癌药物针对的靶点[9]。人类细胞中，存在两条细胞凋亡的通路：①细胞应激触发的内源性凋亡通路，此过程由药物等应激因素诱导，线粒体通透性增高，释放出促凋亡因子，激活caspase-9，进而活化下游的 caspase，最终宿主细胞发生程序性死亡；②死亡受体 Fas 或其他肿瘤坏死因子受体激活的外源性通路，caspase-8 在此过程中活化。两条途径均可引起相同的活化过程，该过程需要 caspase-3 和 caspase-7的蛋白水解活化[10]。细胞色素 C 的释放启动内源性的凋亡通路激活时，Bax/Bak 插入线粒体膜，导致其通透性的升高，从而使多种多肽分子，如细胞色素 C、凋亡诱导因子（AIF）、内切酶 G（EndoG）、Smac/DIABLO 和 HtrA2/Omi 释放到胞浆，启动凋亡通路的活化。在外源性凋亡通路中 caspase-8通过水解作用，使一个含有 BH3 结构域的 Bcl-2 家族蛋白—— Bid 降解活化。Bid 活化后激活 caspase-9，导致线粒体通透性增高，释放细胞色素 C 至胞浆（图 1）。目前caspase 和 IAP 家族蛋白都已成为抗癌治疗的重要靶点。

图1 细胞凋亡的内源性和外源性途径[11]

2.1 DNA 损伤引起依赖于线粒体的内源性细胞凋亡通路

多数常规的抗癌治疗针对的是线粒体依赖的细胞凋亡途径的间接激活，在耐药的肿瘤细胞中此途径经常出现缺陷[12]。抗肿瘤药物在发挥治疗作用时，通常针对靶细胞的胞核 DNA，I 型和 II 型拓扑异构酶抑制剂属于这类药物。II 型拓扑异构酶抑制剂的化疗药物 etoposide 通过作用于线粒体膜，使通透性升高，诱导细胞凋亡。我们曾经报道，EB 病毒编码的转化基因产物 LMP 能增加 etoposide 诱导的 capsase-3 活性[13]。

抑癌蛋白 p53 在 DNA 损伤和细胞凋亡的发生过程的偶联中起着关键作用。DNA 损伤可诱导胞内 p53 水平的升高，诱导胞内 Bcl-2 家族促凋亡成员合成增加。Bcl-2家族促凋亡成员 Bax、Bak、Noxa 和 Puma 与抗凋亡成员Bcl-2、Bcl-X、Mcl-1 浓度比例的改变影响线粒体膜的通透性，决定着细胞对线粒体途径凋亡的敏感性。有实验室还报道，一个启动型 caspase —— caspase-2 也控制着线粒体通透性的增加和促凋亡因子的释放[14-16]。

片螺素（lamellarins）是一族来源于海洋无脊椎动物的六环吡咯生物碱，具有抗肿瘤活性[17]。其中 lamellarin D 对一系列肿瘤细胞具有抑制作用，在 10-6mol/L 浓度水平，就能诱导白血病细胞发生凋亡[17-19]。该药物的促凋亡活性有几种可能的机制。Lamellarin D 具有抑制胞核拓扑异构酶 I的活性，对于 DNA 的切割效率稍弱于经典的拓扑异构酶 I抑制物 campthotecin[20-21]。结构-活性研究显示，lamellarin D衍生物对拓扑异构酶 I 的抑制作用与其毒性存在良好的相关性，提示胞核是 lamellarin D 促凋亡作用的靶点。然而，拓扑异构酶 I 突变的肿瘤细胞对于 lamellarin D 并不完全耐药，提示它对于细胞凋亡的诱导能力也可能依赖于胞内的其他成分。Lamellarin D 及其衍生物能直接地增加线粒体膜的通透性，其发放的信号可诱导内源性细胞凋亡通路的启动，引起 Bax 的活化，降低抗凋亡蛋白 Bcl-2 和 cIAP 活性，同时激活 caspase-3 和 caspase-9。Lamellarin D 诱导细胞色素 C 的释放并不依赖于胞核因子。这些结果提示，lamellarin D 还能以不依赖于核信号的方式，通过细胞凋亡的线粒体途径发挥细胞毒性[22]。

水生生物碱（ASC）是一种来源于海鞘 didemnum sp.[23]和 cystodytes dellechiajei[24]的五环芳香族生物碱，在体外对人类结肠癌、乳腺癌和白血病细胞具有显著的毒性，而且对于药物敏感和多药耐受的细胞系几乎具有同样的毒性，被认为是一种十分有前景的耐药肿瘤细胞细胞毒因子[25]。Dirsch等[26]报道，ASC 可激活caspase-2，导致线粒体途径的激活。由于 caspase-2 的活化先于 casapse-8、-9、-3 的切割活化，因此，caspase-2 抑制剂 zVDVAD fmk 可完全阻断 ASC诱导的 DNA 片段化，Bcl-x(L) 过度表达能阻断 caspase-8的活性，但不能阻断 caspase-2 的活性。相反，casapse-2 抑制对 caspase-9 的活化起到强烈的抑制作用。ASC 切割Bid 被认为是 caspase-2 调控线粒体通透性的中间环节。ASC 还能通过活性氧的产生激活 JNK，在 ASC 诱导的细胞凋亡中发挥作用。ASC 引起 DNA 损伤，激活 caspase-2，进而造成线粒体改变，而 JNK1 在此通路中的作用发生于线粒体上游。

得自海洋线虫 cephalodiscus gilchristi 的天然药物cephalostatin 是一种细胞凋亡的强诱导剂，有可能应用于对多种药物耐药的癌症病例[27]。Cephalostatin具有独特的细胞毒性，能选择性地诱导 Smac/DIABLO 进而诱导细胞色素C 从线粒体中释放。细胞凋亡过程中，caspase-9 被活化，而此过程不需凋亡复合体的参与。在此非经典的 caspase-9激活过程中，还观察到内质网应激相关的 caspase-4 的参与，进一步表明该药物引起凋亡途径的特殊性。另有研究发现，一种启动型 caspase —— caspase-2 在cephalostatin 的作用下，也可诱导 Smac/DIABLO 的释放。Cephalostatin 还能促进 PIDD （p53-induced protein with a DD），RAIDD（RIP-associated ICH-1/CED-3-homologous protein with death domain）与 caspase-2 形成一个凋亡复合物 PIDDosome[26]。此外，还发现 cephalostatin 能通过高磷酸化灭活 Bcl-2，并激活内质网特异的细胞凋亡途径[28-30]。

2.2 Caspase-8 激活的外源性细胞凋亡通路

死亡配体与其相应受体结合，活化的受体在膜上募集连接蛋白，并活化启动型 caspase —— caspase-8 和caspase-10。和内源性通路一样，各种细胞外刺激信号包括海洋药物诱导的 JNK 活化也在外源性细胞凋亡的执行过程中发挥作用。

从地中海有囊动物 aplidium albicans 提取的 aplidine水平就能诱导人类白血病细胞系和原代培养的白血病细胞发生凋亡。以阻断型抗 Fas 抗体抑制 Fas (CD95)/Fas 配体信号通路可部分地抑制 aplidine 诱导的细胞凋亡。在转染Fas cDNA 之后，对 aplidine 表现为抗性的 L929 细胞发生凋亡。Aplidine 能诱导快速而持久的 JNK 活化，以抑制剂姜黄色素或 SP600125 预处理能阻断其活性。细胞外信号调控的激酶（ERK）和 p38 激酶通路不参与 aplidine 诱导的凋亡。Aplidine 对 caspase-3 具有激活作用，在 caspase-3缺陷的 MCF7 乳腺癌细胞不能引起凋亡，进一步证实caspase-3 的促凋亡活性。Aplidine 能刺激细胞色素 C 从线粒体中的早期释放，迅速诱导 Bid 的切割，而后者是连接Fas/Cd95 死亡受体与线粒体诱导细胞凋亡途径的媒介。实验结果提示，aplidine 作用于 Fas/Cd95 和线粒体介导的信号通路，是白血病细胞中一种强烈而快速的凋亡诱导剂，并且对癌细胞和激活的 T 细胞具有选择性的作用[31-35]。早期的研究提示，aplidine 通过抑制蛋白质的合成与降低鸟氨酸脱羧酶活性发挥抑制增殖的效应[35]。Aplidine 具有激活EGFR、Src、JNK 和 p38MAPK 的作用，并且能诱导 AP1家族的 c-JUN、JUN B、JUN D、c-FOS、FRA-1 和 FOS B基因以及 NF-kappaB 的主要成分 p65/REL A，能同时增强AP-1 和 NF-kappaB 的活性，在 JNK 高活性的情况下，对增殖细胞产生高度的细胞毒作用[36]，目前已进入 II 期临床实验。

Irciniastatin A（ISA）[37]和 psymberin[38]均为隐翅虫素型的天然药物，分别从海绵 irciniaramose 和 psammocinia sp.提取得到，分析表明两者是同一化合物[39]。ISA 对人类癌细胞系，具有极为强烈和选择性的细胞毒性[37-38]，并对蛋白质的合成具有强烈的抑制作用，诱导线粒体途径的细胞凋亡，在此过程中伴有应激诱导的蛋白激酶（SAPK）活化。这些激酶包括 JNK 和 p38，其活化过程缓慢而持久，在转染 Bcl-x(L) 的细胞、ISA 诱导 JNK 和 p38 的活化过程则明显缩短[40]。

上述几种能调控细胞凋亡的海洋药物，均通过激活启动型 caspase 诱导细胞凋亡的发生。这些药物在发挥作用的过程中，有些诱导了死亡受体的表达，有些则未观察到Fas/CD95 的改变，而是类似于 IκB 持续表达诱导的细胞凋亡：caspase-8 被活化，线粒体膜通透性增加，促凋亡因子释放到胞浆，但细胞表面死亡受体表达水平未见改变[41]。观察结果提示，在对抗癌药物的作用机制进行进一步认识的同时，对 caspase-8 介导的细胞凋亡过程的认识也有待深化。

3 结论

目前已发现多种海洋药物具有抗肿瘤的活性，其中很多与临床正在使用的抗癌药并无交叉作用。相对于常规使用的抗癌药，某些药物还有独特的作用机制，在抗癌治疗方面显然起到了补充作用。该领域的研究有待继续深入，以期开发出更多具有抗肿瘤活性的天然药物。

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