液相色谱-同位素质谱法测定蜂蜜中糖组分δ13C值
2012-11-28李学民曹彦忠贾光群张进杰钱小清王贺琴
李学民 曹彦忠 贾光群 张进杰 钱小清 王贺琴
(秦皇岛出入境检验检疫局,河北 秦皇岛 066004)
蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露,与自身分泌物结合后,经充分酿造而成的天然甜物质[1]。其保健效果与医疗作用为人们所共识。近年来,由于气候异常蜂蜜产量下降,人工与原料成本加大,导致蜂产品价格上涨,国内外消费需求量增加,出现了少数不法商贩以次充好、掺杂使假的欺骗行为。主要做法是把价格低廉的糖、糖浆等掺入纯正蜂蜜中,破坏了蜂蜜纯天然保健品属性,对蜂蜜真实性健康消费造成严重损害。蜂蜜真实性检测成为急需解决的技术问题。
蜂蜜真实性检测方法有气相色谱法[2]、薄层色谱法[3]、分光光度法[4]、高效液相色谱法[5]、气相色谱-同位素质谱联用法[6]、点特异性天然同位素分馏核磁共振法[7,8]、傅里叶变换红外光谱法[9]、糖类指纹图谱法[10]、差示扫描量热法[11]、近红外光谱法[12]、氨基酸指纹图谱法[13]、稳定碳同位素质谱法[14-17]。通过感官检验以及分析蜂蜜不同理化指标,如糖分、酶值、羟甲基糠醛、脯氨酸等,经与纯正天然蜂蜜指标比较对照,判断蜂蜜掺假。然而,该方法耗时长,灵敏度仅可满足简单的掺假事件,不适合蜂蜜掺假的高通量检测。
随着稳定碳同位素质谱检测技术运用于蜂蜜掺假检测,不法分子掺假手段由以前使用C-4糖,如玉米糖、蔗糖,改为使用C-3植物糖浆,如大米糖浆。原有方法对此无能为力。液相色谱-同位素质谱法采用液相色谱分离,在线测定蜂蜜中各糖组分δ13C值,提高了检测灵敏度。测定结果与纯正蜂蜜各组分δ13C的差值分布区间对比,检测蜂蜜掺假。目前,国外已有实验室利用液相色谱-同位素质谱技术检测蜂蜜中糖组分δ13C值的研究与应用[16,17],因此,建立蜂蜜中各糖组分δ13C值测定方法非常必要。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
美国Thermo Fisher公司DELTA V Plus同位素质谱仪,配备Surveryor 液相色谱与Isolink接口。
LC-IRMS使用的超纯水由Millipore公司制造的Milli-Q系统制备。正磷酸(纯度≥99%)、过二硫酸钠(纯度≥99%)均购于Sigma-Aldrich公司;He气(高纯99.999%,载气)购于北京市亚南气体有限公司;CO2气 (工作标准参考气)购于中国标准物质中心。
化学氧化试剂,0.2 M磷酸和0.2 M过二硫酸钠溶液,存于棕色瓶内。用前需使用超声波和真空过滤脱气。蔗糖 IAEA-CH6(δ13C值: –10.4‰)购于奥地利维也纳国际原子能机构,作为碳稳定同位素参照标准,由SerCon公司提供。
1.2 样品处理
称取200 mg 蜂蜜样品以超纯水溶解,定容至50 ml,过0.45 μm 滤膜至样品瓶供液相色谱-同位素质谱仪测定。样品溶液必须每天新鲜制备。
1.3 色谱、质谱条件
1.3.1 色谱条件
样品溶液进样体积为10 μl,色谱柱为Phenomenex Rezek RCM(Ca2+)300×8mm,洗脱剂为100%的超纯水,流速为0.3 ml/min,磷酸溶液和化学氧化剂的浓度均为0.2 M,在流速0.04 ml/min的条件下,产生适量的氧气,其信号强度在8-10V之间。在洗脱剂与化学氧化剂的容器瓶内始终保持氦气流,防止来自大气中CO2的污染。氦气的载气压力为0.5 bar,Isolink接口内吹扫气压力为1.2 bar,CO2标准气压力为1.2 bar,信号强度在6V左右。氧化反应器温度为99.9 ℃,色谱柱柱箱温度为65 ℃。
1.3.2 质谱条件
离子源:EI离子源;扫描方式:正离子扫描;辅助气压力:0.4MPa; 轰击电压:120.8 eV;
离子源电压:2.97KV;真空度:2.0×e-6 mbar。在每次运行前测定三次CO2标准参考气(每次20s)。一次测定约40 min。在仪器运行中,Thermo Electron Isodat version 3.0软件用于数据处理和计算δ13C。
1.3.3 校准与计算
由于IAEA-CH6是限制购买产品,因此使用IAEA-CH6碳稳定同位素参考标准(δ13C值:–10.4‰)对实验室工作标准(葡萄糖水合物,δ13C值: –26.03±0.2‰)进行校准测定,再使用该标准对CO2气体进行标定,每次测定样品使用CO2标准参考气体计算δ13C值。在每次样品测定时,至少测定一次实验室工作标准(葡萄糖水合物),同时测定实验室蜂蜜质控样品。
2 结果与讨论
2.1 蜂蜜中各种糖组分液相色谱分离条件的选择
由于稳定碳同位素质谱仪具有很高的灵敏度,对于含有碳有机物与无机物,在测定时给质谱仪造成较高水平的背景干扰,因此,蜂蜜糖组分检测不使用氨基柱分离、水和乙腈混合作为洗脱剂。苯乙烯-二乙烯基苯聚合物色谱柱装载阳离子(Ca2+、Pb2+、Na+或 H+),使用超纯水作为洗脱剂是较好的选择。
通过实验比较,反相色谱柱、长柱(300×8 mm)、低流速(<0.6 ml/min)和保持适当的柱温获得较好分离效果。由于适合糖组分分离的色谱柱可选类型与范围较小,柱温优选对建立合理色谱分离非常重要。当柱温较低(30℃)时,输液系统压力增大,容易发生漏液,测定结果重复性不好;果糖、葡萄糖氧化不完全,并且测定周期长,每个测试样品需60 min以上,既造成浪费又降低了工作效率。当柱温较高(80℃)时,虽然缩短了检测周期,但某些糖类容易水解,峰形变差,导致测定结果不准,影响定量;这些因素导致δ13C值不可靠。把柱温选定65℃时,被测组分各峰分离度与峰形均达到最佳效果,测定结果重复性较好,因此最佳的色谱柱温度选定65℃。
选择装载Ca2+离子的色谱柱,对蜂蜜样品进行测定,获得了较好的基线与分离效果(见图1),其中二糖包括蔗糖、松二糖、麦芽糖、异麦芽糖和海藻糖,三糖包括吡喃葡糖基蔗糖,松三糖, 麦芽三糖 和蜜三糖。更换装载不同离子(Ca2+, Pb2+, Na+或 H+)的色谱柱进样测定,比较分析各糖组分的色谱行为,糖组分峰形及分离仅有轻微变化,没有一种色谱柱能够将蜂蜜样品包含所有种类的二糖与三糖完全分离。综上所述,本方法选择Phenomenex Rezek RCM(Ca2+)300×8mm作为蜂蜜中糖组分的色谱分离柱。
2.2 液相色谱-同位素质谱法测定精度
在每次样品测定时均测定蜂蜜质控样品,统计3个月内,测定65个不同日期获得质控样品各糖组分的δ13C值,计算标准偏差,测定结果见表1。
按照前述方法测定,果糖、葡萄糖、二糖和三糖δ13C值标准偏差为0.1~0.5‰。在表1看出,二糖和三糖标准偏差比果糖、葡萄糖稍微高一些,是由于它们在蜂蜜中含量相当低且作为总峰测定,同时诸如LC系统、色谱分离、化学氧化、CO2气体分离单元等因素也存在造成偏差增大的可能性。对于日常蜂蜜分析,表1中标准偏差数据说明,LCIRMS法完全可以满足蜂蜜中果糖、葡萄糖、二糖和三糖δ13C值测定要求。
2.3 纯正蜂蜜各组分Δδ13C值分布区间的确定
应用元素分析-同位素质谱法(EA-IRMS)与液相色谱-同位素质谱法(LC-IRMS)相结合,对采自全国26个省及地区、20个不同蜜种385个纯正蜂蜜样品中蜂蜜、蛋白质及各糖组分δ13C值进行检测,测定结果见表2。从表2看出,各种纯正蜂蜜样品,在蜂蜜、蛋白质、果糖、葡萄糖、二糖和三糖δ13C值的平均值之间有较小差异,见表3。蜂蜜中各组分δ13C值标准偏差不超过1‰,应用各组分δ13C值的差值(Δδ13C 值)检测蜂蜜掺假是适合的。
表1 LC-IRMS法在3个月内测定质控样品重现性数据(n=65)
表2 EA/LC-IRMS法纯正蜂蜜的测定结果(n=385)
表3 表2中纯正蜂蜜样品δ13C值的差值(Δδ13C 值)(n=385)
385个纯正蜂蜜各糖组分Δδ13C测定结果列于表3,从表2、3可以看出,所有的Δδ13C的平均值低于±1.0‰,标准偏差≤0.7‰。通过大量纯正蜂蜜检测,在任何情况下,获得的最大差值不超过2.1‰,因此,在检测大量不同地区、不同蜜种的纯正蜂蜜基础上,获得我国纯正蜂蜜各组分Δδ13C分布区间同时满足:Δδ13Cfru–glu=±1.0‰、Δδ13Cp–h≥–1.0‰、Δδ13Cmax.= ±2.1‰。该结论与文献[17]中Elflein研究结论相符。
2.4 蜂蜜掺假检测应用
应用EA/LC-IRMS法和纯正蜂蜜各组分Δδ13C分布区间,在2010年2月至2011年5月对243个(委托样品)怀疑使用糖浆掺假的蜂蜜样品完成检测。利用已有的EA-IRMS法,测定蜂蜜和蛋白质的δ13C值,计算C-4植物糖含量,C-4植物糖不合格的样品11个,检测掺假只有4.5%。利用EA/LCIRMS法检测,检测结果按照纯正蜂蜜判定准则进行判定时,85个样品不合格,检测掺假达到35%,本方法蜂蜜掺假检出率远高于原来方法。
2009年9月至2011年9月,应用本方法为全国87家蜂产品加工与出口单位检测蜂蜜样品1500多个批次,对检测结果均未提出异议,也未出现由于检测结果不准导致国外退赔现象,有效促进了蜂蜜出口。
3 结论
利用该方法对我国26个省及地区、20个不同蜜种385个纯正蜂蜜样品中蜂蜜、蛋白质及各糖组分δ13C值进行检测,通过统计分析,确定了我国纯正蜂蜜Δδ13C值分布区间,为提高我国蜂产品质量,鉴别蜂蜜掺假提供了技术手段。
[1]GB 18796-2005.Honey.National Standards of the People’s Republic of China (蜂蜜:国家标准).
[2]Doner L W,White J W,Phillips J G.J.Assoc.Off.Anal.Chem.,1979,63(1): 186.
[3]Kushnir I.J.Assoc.Off.Anal[J].Chem,1979., 62 (4): 917.
[4]White J W.J.Assoc.Off.Anal[J].Chem,1980,63 (1): 7.
[5]Kim H J, Richardson M J.Chromatogr.1992, 593: 153.
[6]Ruiz-Matute A I , Soria A C, Martínez-Castro I, Sanz M L.J.Agric[J].Food Chem,2007,55(18):7264-9.
[7]Cotte J F, Casabianca H, Lhéritier J, Perrucchietti C, Sanglar C,Waton H, Grenier-Loustalot M F.Anal chim acta.2007,582(1):125-36.
[8]Bertelli D, Lolli M, Papotti G, Bortolotti L, Serra G, Plessi M J.Agric[J].Food Chem,2010,58(15):8495-501.
[9]Kelly J D, Petisco C, Downey G.J.Agric[J].Food Chem,2006,54(17):6166-71.
[10]Cotte J F, Casabianca H, Chardon S, Lheritier J, Grenier-Loustalot M F.J.Chromatogr.A.2003,1021(1-2):145-55.
[11]Cordella C, Antinelli J F, Aurieres C, Faucon J P, Cabrol-Bass D,Sbirrazzuoli N.J.Agric[J].Food Chem.2002 ,50(1):203-8.
[12]Mishra S, Kamboj U, Kaur H, Kapur P.Int.J.Food Sci[J].Nutr,2010,61(3):306-15.
[13]Cotte J F, Casabianca H, Giroud B, Albert M, Lheritier J,Grenier-Loustalot M F.Anal.Bioanal.Chem.2004 ,378(5):1342-50.
[14]White, J.W.Winters, K.J.Assoc.Off.Anal.Chem.72 (4),907.1989.
[15]Kropf U, Golob T, Nečemer M, Kump P, Korošec M, Bertoncelj J,Ogrinc N.J.Agric.Food Chem.2010,58(24):12794-803.
[16]Cabañero A I, Recio J L, Rupérez M.J.Agric.Food Chem.54(26):9719-27.2006.
[17]Elflein L, Raezke K P.Apidologie, 2008,39(5): 574.