星点设计-效应面法优化碎米糖化液的脱色工艺研究Δ

石继连，杨岩涛，刘文龙，邓凯文，陈 锋，唐 昱，贺福元#

（1.湖南中医药大学药学院中药药性与药效国家中医药管理局重点实验室，长沙 410208；2.湖南中医药大学第一附属医院，长沙 410007）

星点设计-效应面法优化碎米糖化液的脱色工艺研究Δ

石继连1＊，杨岩涛1，刘文龙1，邓凯文2，陈 锋1，唐 昱1，贺福元1#

（1.湖南中医药大学药学院中药药性与药效国家中医药管理局重点实验室，长沙 410208；2.湖南中医药大学第一附属医院，长沙 410007）

目的：采用星点设计-效应面法优化碎米糖化液脱色的工艺条件。方法：以脱色剂活性炭用量、pH值和加热温度为考察因素，以葡萄糖保留率和脱色率为效应值，分别采用多元线性回归和二项式方程拟合，用效应面法优化工艺，制备3批样品并进行验证试验。结果：碎米糖化液活性炭脱色的优化工艺为糖化液加入4%的活性炭后，在pH值3.5～4.5、60℃下脱色，3批样品保留率和脱色率预测值与实测值的平均偏差分别为（5.16±0.12）%、（7.13±0.21）%。结论：本文所建立的脱色工艺简便可行，可为进一步制备注射用葡萄糖的脱色工艺研究提供试验依据。

碎米；糖化液；星点设计；效应面；脱色；工艺

注射用葡萄糖多以玉米为原料加工制备而成，用碎米制备注射用葡萄糖可以提高其深加工附加值。碎米制备注射用葡萄糖的过程中，其糖化液含有色素等杂质需要除去。目前，对碎米制备注射用葡萄糖的研究尚未见报道，更未见碎米糖化液的活性炭脱色工艺研究报道。笔者采用活性炭对糖化液进行脱色，在单因素的基础上进行星点设计试验，用效应面法优化工艺，并进行预测分析，为进一步优化注射用葡萄糖的脱色工艺提供试验依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters1525型高效液相色谱仪（包括Waters 2487检测器及Breeze色谱工作站，美国Waters公司）；TU-1900型双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；AR1140/C型分析天平（瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司）。

1.2 试药

糖化液（本实验室自制，固形物含量为（30±1）%）；活性炭（台山市化工厂有限公司，批号：20090401，分析纯）；D-无水葡萄糖对照品（中国食品药品检定研究院，批号：1108334-200503，纯度≥99.0%）；乙腈为色谱纯，流动相用水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 葡萄糖的含量测定

2.1.1 对照品溶液的制备。精密称取D-无水葡萄糖对照品适量，置50 mL量瓶中，加水溶解，定容至刻度，摇匀制成浓度为75.0 mg·mL－1的对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备。将混合均匀的糖化液原液以滤纸抽滤，滤液以0.45μm微孔滤膜过滤，得供试品溶液。

2.1.3 色谱条件。色谱柱：UltimateXB-WH2（250 mm×4.5 mm，2.5 µm）；流动相：乙腈-水（65∶35），流速：1 mL·min－1；柱温：30℃；检测波长：209 nm；进样量：10µL。理论板数按葡萄糖计不低于4 500。

2.1.4 标准曲线制备。分别精密量取1 mL葡萄糖对照品溶液，置2、5、10、25、50 mL量瓶中，加超纯水稀释至刻度，制成37.5、15.0、7.5、3.0、1.5 mg·mL－1的溶液，分别吸取10 μL注入高效色谱仪中，测定峰面积，以峰面积（Y）为纵坐标，相应的浓度（X）为横坐标，绘制标准曲线，回归方程为Y＝71 346X+43 892（r＝0.999 7），表明葡萄糖检测浓度在1.5～37.5 mg·mL－1范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。同时以等量的水进样作为阴性对照。色谱见图1。

图1 高效液相色谱A.阴性对照（水）；B.对照品；C.供试品；1.葡萄糖Fig 1 HPLC chromatogramsA.negativecontrol（water）；B.substancecontrol；C.test sample；1.glucose

2.1.5 精密度试验。取对照品溶液连续进样测定6次，分别测定其峰面积，计算RSD＝1.16%，表明仪器精密度良好。

2.1.6 稳定性试验。取同一供试品溶液，分别于放置0、2、4、8、12、24 h后测定峰面积，计算RSD＝2.72%，表明供试品在24 h内稳定性良好。

2.1.7 重复性试验。取同一批糖化液6份，按“2.1.2”项下的方法制成供试品溶液，按“2.1.3”项下的条件测定其峰面积，计算RSD＝2.07%，表明本法有较好的重复性。

2.1.8 加样回收率试验。精密量取已知葡萄糖含量（24.6 mg·mL－1）的糖化液9份各100 mL，分别精密加入80%、100%和120%的葡萄糖对照品各3份，按“2.1.2”项下的方法制成供试品溶液，按“2.1.3”项下的条件测定其含量并计算，低、中、高浓度的平均回收率分别为100.91%、98.54%和96.83%，平均加样回收率为98.76%，RSD＝2.07%。

2.1.9 葡萄糖保留率的测定。测定脱色后的糖化液中葡萄糖含量，与未经活性炭脱色品比较，计算其葡萄糖保留率：保留率（%）＝（脱色后葡萄糖含量/脱色前葡萄糖含量）×100%。

2.2 色素吸光度的测定[1]

将滤纸过滤后的糖化液和葡萄糖对照品溶液分别进行全波长扫描。结果表明，糖化液在254 nm波长处有最大吸收，而对照品溶液在此处基本无吸收，故选择此波长为检测波长，测定糖化液的吸光度。用蒸馏水作空白液，在254 nm波长处测定脱色后的吸光度。脱色率（%）＝[（脱色前色素吸光度－脱色后色素吸光度）/脱色前色素吸光度]×100%。

2.3 星点设计法优化脱色条件

2.3.1 试验设计及结果。根据单因素考察实验的结果[2]，对3个影响因素（x1：活性炭用量；x2：温度；x3：pH值）进行星点设计，进一步筛选影响其脱色效果的工艺条件。精密量取100 mL糖化液，置具塞锥形瓶中，按表1、表2的安排，分别加入一定比例的活性炭，用盐酸或氢氧化钠溶液调pH值，在一定温度下水浴脱色30 min（不时振摇），取出，冷却至室温，分别滤纸抽滤2次，按上述方法分别测定葡萄糖的保留率和脱色率。因素水平见表1，试验结果见表2（注：15～20号为重复实验，实验结果用平均值表示）。

表1 因素水平Tab 1 Factorsand levels

表2 星点设计试验结果Tab 2 Resultsof central compositedesign methodology

2.3.2 模型拟合。分别以葡萄糖保留率（Y1）和脱色率（Y2）为因变量，对各因素进行多元线性回归和二项式拟合。多元线性回归方程分别为：Y1＝91.824+0.122x1+0.005x2+0.528x3（r＝0.523 4，F＝1.382（P＞0.05））；Y2＝60.676+4.061x1－0.05x2－1.439x3（r＝0.689 1，F＝3.321（P＞0.05））。二项式拟合方程分别为：Y1＝70.874+x1+0.005x2+8.13x3－0.036x12－0.676x32+0.004x1x2－0.114x1x3+0.001x2x3（r＝0.782 3）；Y2＝69.194+14.359x1－0.435x2－13.144x3－0.759x12+0.003x22+1.13x32+0.018x1x2+0.152x1x3－0.014x2x3（r＝0.880 3）。

从拟合结果可见，多元线性回归方程的相关系数r较低，表示自变量与因变量之间线性相关性较差，可见多元线性回归拟合度不佳、预测性较差，因此，该数学模型不合适。而多元二项式拟合方程相关系数较高，拟合效果较好。

2.3.3 工艺优化和预测。因变量曲面图是三维图，只能表达2个自变量的函数，因此固定3个自变量之一为中值，以拟合的目标函数为数学模型，采用Minitab软件绘制三维效应面图，结果见图2。

考虑到工艺生产中实际成本以及实际实验误差等问题，本研究选取碎米糖化液的脱色优化工艺为：x1：4%，x2：60℃，x3：3.5～4.5，即加入4%活性炭后，在pH值3.5～4.5（按糖化液的原有酸度）时于60℃下脱色30 min。

2.3.4 优化工艺验证。按上述较优工艺条件，精密量取100 mL糖化液，置具塞锥形瓶中，分别加入4%的活性炭，在60℃下水浴脱色30 min（不时振摇）。制备3批样品进行工艺验证，分别测定葡萄糖的保留率和脱色率，并将测定的平均结果与拟合方程的预测值进行比较，计算其相对偏差[相对偏差＝（预测值－实测值）/预测值×100%]，验证结果见表3。

结果表明所建立的数学模型具有良好的预测性，所选工艺条件重现性好。

图2 3种因素的三维效应面图Fig 2 Three-dimensional responsesurfaceof 3 factors

表3 3批样品的验证结果（%%）Tab 3 Resultsof validation testsof 3 batches（%%）

3 讨论

星点设计是多因素5水平的试验设计，在二水平析因设计的基础上加上极值点和中心点构成，各水平的安排遵循任意2个物理量之间的差值与对应代码之间的差值成等比的原则。效应面优化的基本原理则是通过描绘效应对考察因素的效应面，从效应面上找出较优的区域，再回推出因素的取值范围，此范围即为最佳条件[3]。本文在单因素考察的基础上，采用星点设计-效应面法，优化了碎米糖化液的脱色工艺，若进一步结合吸附蛋白质等其他杂质的情况进行深入细致的研究，可得到碎米制备注射用葡萄糖的最佳脱色工艺条件。为此，本研究已申请专利（申请号为：201010547831.2）。

目前测定葡萄糖含量的方法多是紫外分光光度法，有文献[4]中高效液相色谱法测定葡萄糖含量所用流动相为水，经预试发现对本研究糖化液样品的分离效果较差而改用本文所述，取得了较好的分析效果。本文所建立的脱色工艺简便可行，可为进一步制备注射用葡萄糖的脱色工艺研究提供试验依据。

[1] 周鸿立，吴德恒，董卫权，等.玉米须多糖脱色工艺条件的研究[J].上海中医药杂志，2010，44（4）：76.

[2] 石继连，刘文龙，杨岩涛，等.碎米糖化液的脱色工艺研究[J].中国药师，2011，14（12）：1 734.

[3] 吕邵佳，刘 栋，胡畔盼，等.星点设计-效应面法优化龙芽楤木叶提取工艺[J].中药材，2010，33（3）：442.

[4] 宋更申，姜建国，孙 婷.HPLC法测定葡萄糖氯化钠注射液中葡萄糖的含量[J].中国药房，2010，21（1）：74.

Optimization of Decolorization Technology of Saccharification Liquid from Broken Rice by Central Composite Design-response Surface Methodology

SHI Ji-lian，YANG Yan-tao，LIU Wen-long，CHEN Feng，TANG Yu，HE Fu-yuan
（Key Laboratory of Drug Properties and Pharmacodynamics，State Administration of TCM，School of Pharmacy，Hunan University of TCM，Changsha 410208，China）
DENG Kai-wen
（The First Affiliated Hospital of Hunan University of TCM，Changsha 410007，China）

OBJECTIVE：To optimize the decolorization technology of saccharification liquid from broken rice by central composite design and response surface methodology.METHODS：The decolorization technology was optimized by response surface methodology（RSM）with dosage of decoloring agents，pH value and heating temperature as factors using the retain rate and the decoloring rate of glucose as index.The multiple linear regression and binomial regress equation were fitted respectively，and validation test of 3 batches of samples was carried out.RESULTS：The optimum decolorization conditions of saccharification liquid from broken rice were 4%active carbon，pH value of 3.5～4.5，at 60℃.Average deviation of predicted value and measured value of retention rate and decoloring rate were（5.16±0.12）%and（7.13±0.21）%in 3 bathes of samples.CONCLUSION：The decolorization technology is simple and practicable.It can provide experimental basis for further study on decoloring technology of Glucose for injection.

Broken rice；Saccharification liquid；Central composite design；Response surface；Decolorization；Technology

R944.1

A

1001-0408（2012）41-3899-03

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2012.41.23

Δ湖南省科技厅资助项目（2010SK3019）

＊副教授，硕士研究生导师，硕士。研究方向：中药炮制与制剂。电话：0731-88458242。E-mail：HNSJL@163.com

#通讯作者：教授，博士研究生导师，博士后。研究方向：中药制剂、药性与药效。电话：0731-88458231。E-mail：pharmsharking@tom.com

2011-12-08

2012-01-29）

Δ广州市科技局基金项目（2009J1-C101）

＊主任药师。研究方向：临床药学、药物分析、药物制剂。电话：020-83595977。E-mail：taotao9888@163.com