黄芩总黄酮及黄芩苷对大鼠成骨细胞及破骨细胞活性的研究

严启新，赵文娟，殷 明，冯汉林，王泽剑*

1深圳市海王生物工程股份有限公司，深圳518057;2上海交通大学药学院，上海200240

黄芩总黄酮及黄芩苷对大鼠成骨细胞及破骨细胞活性的研究

严启新1，赵文娟2，殷 明2，冯汉林1，王泽剑2*

1深圳市海王生物工程股份有限公司，深圳518057;2上海交通大学药学院，上海200240

为观察黄芩总黄酮及黄芩苷对新生大鼠成骨细胞及破骨细胞活性影响，给SD大鼠灌胃给药3 d后取含药血清，分离成骨细胞及破骨细胞体外培养，MTT法检测成骨细胞活性，AKP检测成骨细胞分化程度，用骨吸收陷窝数量评价破骨细胞活性。结果表明，与对照组相比，含黄芩总黄酮及黄芩苷血清剂量依赖性地促进成骨细胞增殖;其通过促进成骨细胞的增殖和分化，抑制破骨细胞的活性，对临床骨质疏松的防治具有积极意义。

黄芩总黄酮;黄芩苷;成骨细胞;破骨细胞

骨质疏松症(简称为骨质疏松)是全身骨骼成分减少的一种骨骼疾病，主要表现为骨组织内单位体积中骨量减少，骨矿物质和骨基质随年龄的增加(或妇女绝经后)等比例的减少，骨组织的显微结构发生改变而致其骨组织的正常荷载功能发生变化。黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)为常用中药之一，具有清热燥湿、泻火解毒、止血安胎等功效。其主要有效成分为黄酮类化合物。目前从黄芩中已发现40多种黄酮类化合物，其中含量较高并具有明显药理作用的是黄芩甙、黄芩素、汉黄芩素和汉黄芩甙。现代药理研究证明黄芩［1］不仅具有明显的抗菌消炎、抗过敏、抗氧化、抗致癌和抗病毒的作用，而且对心血管也具有一定作用。总之，黄芩及其所含黄酮有其广泛的药理作用，但对其抗骨质疏松的研究，在国内外相关文献，均无抗骨质疏松及其相关的报道。本文，以尼尔雌醇和强骨胶囊为对照，首次观察了黄芩提取物及黄芩苷对新生大鼠成骨细胞增殖及分化的影响，探讨其对骨质疏松的潜在治疗作用。

1 药品、仪器与试验动物

黄芩苷(大于95%，HPLC检测)、黄芩总黄酮提取物Ⅰ(含量约70%，大孔树脂制备，UV法测定)、黄芩总黄酮提取物Ⅱ(含量约50%，酸碱制备方法，UV法测定)、黄芩总黄酮提取物Ⅲ(含量约30%，乙醇提取，UV法测定)、黄芩总黄酮提取物Ⅳ(含量约25%，水提取，UV法测定);强骨胶囊(北京岐黄制药有限公司，0.25 g/粒，批号:031002);尼尔雌醇片(上海华联制药有限公司生产，2 mg/片，批号:040301)

仪器:ELX800酶标仪美国BioTek公司;I型胶原免疫组化染色试剂盒购自武汉博士得生物工程有限公司。

SD大鼠，雌雄各半，体重为200±10 g，购自中国科学院上海实验动物中心，清洁级，合格证号:中科动管第004号;许可证号:SCXK(沪)2002-0010。

2 试验方法

2.1 含药血清的制备［2，3］

选择SD 3月龄大鼠，雌雄各半，随机分为8组，即为对照组(CMC)、尼尔雌醇组、强骨胶囊组、黄芩苷组、黄芩总黄酮提取物Ⅰ组、黄芩总黄酮提取物Ⅱ组、黄芩总黄酮提取物Ⅲ组、黄芩总黄酮提取物Ⅳ组。分别给予1%CMC、各200 mg/kg的黄芩总黄酮提取物组Ⅰ、黄芩总黄酮提取物Ⅱ、黄芩总黄酮提取物Ⅲ、黄芩总黄酮提取物Ⅳ、100 mg/kg的黄芩苷组、强骨胶囊90 mg/kg灌胃给药，每日给药2次，连续给药1周;尼尔雌醇1 mg/kg每周给药一次，末次给药1 h后，心脏采血，静止1 h后在离心机上以2000 g离心20 min，合并收集同组血清，56℃水浴灭活30 min，-20℃保存备用。使用前培养基稀释，过滤膜除菌(滤膜孔径为0.22 μm)。

2.2 细胞培养［4］

新生大鼠颅盖骨成骨细胞培养方法。1日龄的新生SD大鼠拉颈处死，75%酒精浸泡后取头盖骨，剔除软组织后剪碎，加入0.2%的Ⅰ型胶原酶，消化5个循环，每次20 min，收集第3、4、5次消化的细胞悬液，800 g离心10 min，弃上清，沉淀的细胞用10%胎牛血清DMEM培养基重悬，吹打均匀，接种至培养瓶，于37℃5%CO2孵箱孵育，24 h换液，待细胞60%～70%贴壁后，用0.25%胰酶消化，即为本实验的原代成骨细胞。原代细胞长成致密单层后，用0.25%胰蛋白酶进行消化，以1∶3比例传代，以后每2天换液1次，长成致密单层后用于实验。

2.3 细胞鉴定

倒置显微镜下观察:培养第2天大部分细胞贴壁，贴壁后主要为梭形、圆形或鳞片状;3～4 d时细胞突起伸展，相互搭连成片，长满瓶底时，细胞为梭形及立方块状，排列紧密，并可见圆形及鳞片状细胞。随着培养时间的延长，可见成骨细胞呈多层生长。

2.4 细胞增殖实验［4］

培养板中每孔加入100 μL细胞悬液(1×105个/mL)，在37℃，5%CO2孵育箱中培养，使细胞贴壁，换含不同浓度、种类的含药血清，继续培养48小时，并于结束培养前4 h，每孔加入10 mg/mL的MTT。培养结束后，弃培养液，每孔加入100 μL的DMSO，振摇15 min，酶标仪于490 nm处检测各空OD值。

2.5 碱性磷酸酶活性测定［5］

旅行商问题(Traveling Salesman Problem,)是路径规划和组合优化领域中著名的NP-hard问题[1,2]，网络路由的大规模优化[3]、超远距离泵送混凝土造价控制技术[4]、车辆路线设计[5]等均是典型的TSP。目前，求解TSP的算法可分为精确算法(exact algorithm)和近似算法(approximation algorithm)两类。Wang等在分析基于智能算法的TSP求解方法优缺点[6,7]的基础上，指出遗传算法受参数选择和数据集分布结构的影响最小，陷入局部最优的概率最小。

培养板中，每孔加入0.1 mL成骨细胞悬液(1 ×106个/mL)，贴壁后加药方法同前，细胞培养2 d后，取细胞培养液50 μL，各孔均加碱性磷酸酶试剂盒新鲜配制的底物2.55 mL，37℃孵育30 min，双蒸水空白调零，在722分光光度计520 nm波长处检测其吸光度A值。

2.6 骨磨片的制备

取新鲜牛股骨，用锯式切片机(Leitz 1600)切割成厚度约50 μm的薄切片，剪成6 mm×6 mm大小，于灭菌的双蒸水中超声(SB2200，80W)清洗(50 Hz ×5 min)，连续3次后，紫外灯照射8 h(每面4 h)，备用［5，6］。

2.7 破骨细胞分离与培养

取1日龄SD大鼠，拉颈处死，75%酒精浸泡5 min，无菌分离四肢长骨，剔净软组织，用MEM培养液清洗2次，用解剖刀纵向剖开骨干，将骨质内表面刮入培养液(MEM全培养液，含20%胎牛血清，100 U/mL硫酸链霉素、100 U/mL青霉素钠，pH 7.2)。再以圆头吸管吹打骨碎片5 min，静置30 s，吸取上层细胞悬液均匀接种于预置有骨磨片的24孔培养板中，37℃5%CO2孵箱孵育30 min，以MEM培养液冲去未贴壁的细胞，更换全培养液至每孔2 mL，继续培养，3 d更换一次培养液。

2.8 骨吸收陷窝观察与计数

培养8 h后，更换为加有含药血清或对照血清的培养液，培养至第7 d，取出所有骨磨片，2.5%戊二醛固定，于0.25 mol/L氢氧化铵超声波清洗5 min×3次，系列梯度酒精脱水，自然晾干，1%甲苯胺蓝染液室温染色，3～4 min，蒸馏水清洗，于光镜100倍下对整张骨磨片上的吸收陷窝计数，结果以陷窝数/片计。

3 统计处理

4 结果

4.1 供试药物血清对成骨细胞增殖和分化功能的影

结果见表1及表2，从表1可以看出，与对照组相比，10%黄芩总黄酮提取物血清Ⅰ、10%黄芩总黄酮提取物血清Ⅱ、10%黄芩总黄酮提取物血清Ⅲ、10%黄芩总黄酮提取物血清Ⅳ及5%黄芩苷血清对成骨细胞增殖具有显著统计学意义(P＜0.05);与对照组相比，20%黄芩总黄酮提取物血清Ⅰ、20%黄芩总黄酮提取物血清Ⅱ、20%黄芩总黄酮提取物血清Ⅲ、20%黄芩总黄酮提取物血清Ⅳ及10%黄芩苷血清对成对成骨细胞增殖具有非常显著统计学意义(P＜0.01)。黄芩总黄酮各组及黄芩苷促进成骨细胞增殖作用与强骨胶囊相似，显著优于尼尔雌醇组(P＜0.05)。黄芩总黄酮提取物血清和黄芩苷血清浓度提高后，显著的提高了成骨细胞增殖能力(P＜0.01)，具有一定的剂量依赖性。

表1 含供试药物血清对成骨细胞增殖的影响:A 490 nm(n=7)Table 1 Effects of agents containing serum on the proliferation of osteoblasts:A 490 nm(n=7)

从表2可以看出，与对照组相比，10%、20%含药血清中黄芩总黄酮各组及黄芩苷对成骨细胞分泌碱性磷酸酶具有显著促进作用(P＜0.01)，在我们的实验条件下，与强骨胶囊的作用相似;10%黄芩苷血清组促进成骨细胞分泌AKP的作用显著优于尼尔雌醇组(P＜0.05)。黄芩总黄酮提取物血清和黄芩苷血清浓度提高后，对成骨细胞分泌碱性磷酸酶促进作用无明显提高，提示高浓度的血清可能促进成骨细胞增殖，抑制细胞进一步分化。

表2 含供试药物血清对成骨细胞分泌AKP活性的影响:A 570 nm(n=7)Table 2 Effects of agents containing serum on the activities of AKP secretory from osteoblasts A 570nm(n=7)

本试验结合成骨细胞的生长及分化指标对黄芩系列药物进行了评价，结果显示:它们对成骨细胞的增殖及分化均有一定的促进作用。

4.2 供试品对破骨细胞骨吸收功能的影响

从表3中可以看出，与对照组相比，10%黄芩总黄酮提取物Ⅰ和Ⅳ含药血清显著抑制破骨细胞对骨片的吸收功能，减少骨陷窝形成具有非常显著统计学意义(P＜0.05);与对照组相比，20%含药血清中黄芩总黄酮各组及10%的黄芩苷显著抑制破骨细胞对骨片的吸收功能，减少骨陷窝形成具有非常显著统计学意义(P＜0.01);黄芩总黄酮提取物血清和黄芩苷血清浓度提高后，虽然剂量依赖性的抑制了破骨细胞对骨片的吸收功能，但不具备统计学意义，可能与血清本身浓度提高后促进破骨细胞增殖，进而骨陷窝形成增多有关。

表3 含供试药物血清对骨片骨陷窝计数的影响(n=6)Table 3 Effects of agents containing serum on the numbers of absorption lacuna in bone sheets(n=6)

5 讨论

本试验在成功培养出成骨细胞基础上，观察了大鼠灌胃给药后得到的血清对成骨细胞增殖、分化的影响。AKP约40%～75%由成骨细胞产生，其活性可反映成骨细胞功能的强弱，也是成骨细胞分化的标志之一。本试验结合成骨细胞的生长及分化指标对黄芩系列药物进行了评价，结果显示:黄芩总黄酮及黄芩苷对成骨细胞的增殖及分化均有一定的促进作用。与低浓度含药血清(10%黄芩总黄酮血清或5%黄芩苷血清)相比，高浓度的含药血清(20%黄芩总黄酮血清或10%黄芩苷血清)显著促进成骨细胞的生长(P＜0.05)，对成骨细胞分化和破骨细胞骨吸收功能虽然有剂量依赖性的提高，但缺乏统计学差异，可能与血清浓度提高促进成骨细胞和破骨细胞的增殖有关。

本研究利用原代培养的破骨细胞进行骨吸收试验。结果显示:黄芩总黄酮及黄芩苷对破骨细胞功能有一定剂量依赖性的抑制作用。说明其防治骨质疏松作用，部分是通过抑制破骨细胞的功能实现的。

1 Ren XD(任晓东)，Fu W(符伟)，Zhang XY(张晓芸)，et al.Progress in research of the natural product wogonin.Chin J New Drugs(中国新药杂志)，2011，20:777-784.

2 Huang P(黄萍)，Shao P(绍培)，Zhao ML(赵美林)，et al.Cinnamaldehyde on osteoblast cell proliferation and activity of alkaline phosphatase.Chin J Oral Implantol(中国口腔种植学杂志)2009，14(6):15-17.

3 Jia M(贾敏)，Zhang H(张寒).Effect of total glucosides of peony on osteoblasts and osteoclasts in vitro.Northwest Pharm J(西北药学杂志)，2010，25:357-359.

4 Wang YD(王永东)，Wu XR(武晓蓉).Effect of serum of Astragalus from rats on the osteogenic capacity of osteoblasts.J Guangdong Pharm Univ(广东药学院学报)，2004，20:512-514.

5Ren YL(任艳玲)，Zheng HX(郑洪新)，Du S(杜松).Experimental research of the serum contained tonic-kidney and benefiting spleen herbs function to the proliferation and differentiation of the vitro-cultured osteoblasts.Chin J Inform Tradit Chin Med(中国中医药信息杂志)，2004，11:772-774.

Effects of Total Flavonoids of Scutellaria baicalensis Georg and Baicalin Containing Serum on Activities of Osteoblasts and Osteoclasts

YAN Qi-xin1，ZHAO Wen-juan2，YIN Ming2，FENG Han-lin1，WANG Ze-jian2*1Shenzhen Neptunus Bioengineering Co.Ltd，Shenzhen，Guangzhou 518057;2Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200240

To investigate the effects of serum from the total flavonoids of Scutellaria baicalensis Georg and baicalin fed rats on the activity of osteoblasts or osteoclasts，primary cultured osteoblasts and osteoclasts were isolated from the skull and the limbs of newborn rats respectively.MTT assay was used to evaluate the cell viability.AKP activity was used to evaluate the function of osteoblasts.The numbers of resorption pits on born surface were counted to evaluate the activity of osteoclasts.Compared with control group，the serum containing the total flavonoids of S.baicalensis and baicalin significantly promoted the proliferation of osteoblasts and enhanced the secretion of AKP from osteoblasts after two days incubation.The activities of osteoclasts were also inhibited by the serum containing the total flavonoids of S.baicalensis and baicalint.These results indicated a potential clinical use of total flavonoids of S.baicalensis and baicalin against osteoporosis.

flavonoids of Scutellaria baicalensis Georg;baicalin;osteoblasts;osteoclasts

1001-6880(2012)10-1367-04

2011-09-22 接受日期:2012-02-06

*通讯作者 Tel:86-21-34206836;E-mail:wangzejian@sjtu.edu.cn

R285.5

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