几种天然产物对痛风性关节炎的影响初探

史 珅，贺 伟，胥红梅，李 森，张葳芮，张泽生3，

1天狮集团有限公司博士后工作站;2天津市天狮生命科学与技术研究院，天津301700; 3天津科技大学博士后流动站;4天津科技大学食品营养与安全省部共建教育部重点实验室; 5天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457

几种天然产物对痛风性关节炎的影响初探

史 珅1，2，3，4，5*，贺 伟4，5，胥红梅4，5，李 森4，5，张葳芮1，2，张泽生3，4，5

1天狮集团有限公司博士后工作站;2天津市天狮生命科学与技术研究院，天津301700;3天津科技大学博士后流动站;4天津科技大学食品营养与安全省部共建教育部重点实验室;5天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457

为了探讨几种天然产物对痛风性关节炎模型大鼠的影响，通过对wistar大鼠踝关节注射尿酸钠结晶，制作痛风性关节炎模型，并预先对实验大鼠灌胃给药褐藻糖胶、柠檬酸钾和东哥阿里提取物，通过检测踝关节肿胀度、步态积分及血清样本中炎症因子变化，研究其对痛风性关节炎的预防和缓解作用。结果发现，三种活性物质均可显著降低痛风性关节炎实验大鼠造模24 h踝关节肿胀度;东哥阿里提取物对实验大鼠步态积分有降低作用;褐藻糖胶与东哥阿里提取物对髓过氧化物酶有显著降低作用;东哥阿里提取物可以显著降低炎症因子IL-1β、IL-8、NO和5-HT的血清浓度;因而推测，三种活性物质均对尿酸钠引起的痛风性关节炎有预防和缓解作用，其中东哥阿里提取物在减轻关节肿胀、缓解痛感及抑制炎症发展方面有显著作用。

尿酸;痛风性关节炎;褐藻糖胶;柠檬酸钾;东哥阿里;大鼠

痛风是长期嘌呤代谢障碍，血尿酸增高引起组织损伤的综合病症。临床表现以急性痛风性关节炎最为常见［1］，严重者可致关节活动障碍、畸形，肾尿酸结石及痛风性肾实质病变等［2］。局部急性炎症反应一般表现为红、肿、热、痛和功能障碍五个方面。

尿酸为一种弱酸性物质，溶解度很低，易呈针状结晶析出沉积在温度较低的远侧端肢体(如足趾)和酸度较高的组织(如运动后的肌肉、关节腔)。主要侵犯部位是关节的滑囊膜和关节软骨、肾脏和皮下软组织，因为关节软骨、滑膜内及关节周围组织中血管较少［3］，运动后更易发生缺氧，加速糖分解而形成乳酸，于是pH降低，尿酸钠沉积增多;此外基质中含黏多糖酸及结缔组织较丰富，因此尿酸盐容易沉积。大量尿酸盐结晶进入关节腔后，尿酸盐结晶通过刺激炎性介质的合成和释放来诱发和维持强烈的炎性反应。

本文旨在研究褐藻糖胶、柠檬酸钾及东哥阿里提取物对痛风性关节炎的预防和缓解作用。实验采用Wistar雄性大鼠为实验动物，对其灌胃上述三种活性物质的生理盐水溶液14 d，在给药11 d时通过对大鼠右踝关节注射尿酸钠溶液制作痛风性关节炎模型，在造模后24 h测定其踝关节肿胀程度，并在不同时间点观察其步态，造模72 h后对大鼠股动脉取血，检测血清中的炎症因子及相关指标，以初步探讨三种物质对痛风性关节炎的影响和作用机制。

1 对象与方法

1.1 材料

生化试剂盒(南京建成生物工程研究所)，紫外可见可变波长分光光度计(日本岛津)，酶联免疫生化试剂盒(RD，进口分装)，MK-32酶标仪(美国赛默飞世尔科技公司)。

Wistar大白鼠，SPF级，雄性，体重300±20 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号:SCXK(京)2006-0009。尿酸(Ameresco)，生理盐水(天津市北方天医化学试剂厂)。

褐藻糖胶(Fucoidan≥60%，上海森一生物科技有限公司)，柠檬酸钾(≥99%，北京凤礼精求商贸有限责任公司)，东哥阿里提取物(100∶1，上海森一生物科技有限公司)，-20℃保存。

1.2 方法

饲养条件为屏障系统动物房，温度22±2℃，相对湿度40%～60%，控制照明时间为14∶10 h。将健康大鼠随机分成5组，每组8只，分别为空白对照组、模型对照组、褐藻糖胶组、柠檬酸钾组和东哥阿里提取物组。褐藻糖胶、柠檬酸钾和东哥阿里提取物给药剂量为200 mg/kg·bw/d，空白组和模型组灌胃等量生理盐水。

尿酸钠结晶(monosodium urate，MSU)及尿酸钠溶液的制备［4］:194 mL蒸馏水加6 mL 1M NaOH，煮沸，加1 g尿酸，用1N HCl调pH至7.2，搅拌冷却，4℃冰箱保存24 h，去上清，用滤纸将沉淀物水分吸干，放入70℃干燥箱烘2 h，取出，刮下粉末，放入研钵内研成细末，用孔径250 μm的金属筛过筛，制成尿酸钠结晶。取1 g尿酸钠加9 mL生理盐水，l mL吐温80，经乳化机乳化，配制成10 mL 10%尿酸钠溶液，高温灭菌后备用。

动物模型的制作:第11 d灌胃给药后，将50 μL浓度为10%的尿酸钠溶液注入踝关节腔，空白组注射等体积灭菌生理盐水，在踝关节同一固定位置用油性笔画一位置作为标记用于测量踝关节的体积。

1.3 样本的采集及测试方法

关节肿胀度的测定:根据排水容积法自制肿胀测量仪，测量大鼠造模踝关节同一部位的足容积，实验时分别在造模0 h和24 h测量大鼠的踝关节体积，并计算造模24 h时大鼠踝关节肿胀率。

步态积分的评定:造模后24、48 h观察各组大鼠的步态，进行评分并统计学分析，按Coderre等［5］介绍的步态分级标准进行评分，0分:正常行走，后肢正常压力，两侧后肢平等负重;1分:轻微跛行，受试下肢略有弯曲，模型侧后肢负重轻度减少，可完全触地;2分:中度跛行，受试下肢刚触及地面，后肢压力中度减少，腿屈曲仅有部分肢体负重，接触地;3分:重度跛行，受试下肢离开地面，三足着地行走，后肢负重严重减少，少接触地。

炎症因子的测定:造模72 h后股动脉取血，收集血液，4℃、1500 g离心15 min分离血清，Elisa试剂盒测定相关炎症因子水平。髓过氧化物酶(Myeloperoxidase，MPO)的测定采用南京建成生化试剂盒。

统计学方法:实验数据均用SPSS 13.0统计软件进行处理，用单因素方差分析ANOVA(one-way analysis of variance)。分析实验结果以均值士标准偏差(±s)表示，P＜0.05具有显著性差异，P＜0.01具有极显著性差异。

2 结果与讨论

2.1 实验大鼠体重变化

图4-1是实验大鼠给药阶段的体重变化趋势图。由图可见，各组实验大鼠体重增长趋势基本一致，给药各实验原料对实验大鼠正常生长无显著影响。

图1 实验大鼠体重变化趋势Fig.1 Body weight trends of Experimental rats

2.2 实验大鼠踝关节肿胀度和步态积分

造模24 h各组大鼠踝关节肿胀率的变化见图2，模型组实验大鼠踝关节肿胀度显著(P＜0.01)高于空白对照组。褐藻糖胶、柠檬酸钾和东哥阿里提取物在造模后24 h均显著(P＜0.05)降低了实验大鼠踝关节的肿胀度。

图2 实验大鼠造模后24 h踝关节肿胀率Fig.2 Rate of ankle swelling of rats in 24 hours after modeling

造模24、48 h后对大鼠的步态进行了观测评价，各实验原料对MSU致痛风关节炎大鼠步态的影响见图3和图4。与正常组大鼠相比，模型组大鼠注射MSU溶液后，活动减少，右后肢弯曲，行走时后肢抬起。由图3可见，造模24 h时，褐藻糖胶组和东哥阿里提取物组实验大鼠的步态积分均值较模型组降低;由图4可见，造模48 h时，东哥阿里提取物组的步态积分均值较模型组降低。

2.3 实验大鼠炎症相关指标

图5 实验大鼠血清髓过氧化物酶活力Fig.5 Myeloperoxidase activity in serum of experimental rats

MPO是指征中性粒细胞活性的重要直接指标，图5是痛风性关节炎实验大鼠血清MPO的比较。其中，模型对照组大鼠血清MPO显著(P＜0.05)高于空白对照组，可见该炎症模型中，中性粒细胞活性增强，参与炎症发生发展。在给药组中，褐藻糖胶组和东哥阿里提取物组显著(P＜0.05)低于模型对照组。

炎症介质中，本文主要关注了白细胞介素1β (Interleukin-1β，IL-1β)、白细胞介素8(Interleukin-8，IL-8)、一氧化氮(Nitric oxide，NO)和五羟色胺(5-Serotonin，5-HT)，表1是各因子在血清中水平的比较。与空白组比较，模型组血清IL-1β显著(P＜0.01)高于空白对照组;东哥阿里提取物组显著(P＜0.01)降低。模型组实验大鼠血清IL-8水平显著(P＜0.05)高于空白对照组;其中东哥阿里提取物组显著(P＜0.05)低于模型对照，且与空白对照组无显著差异。模型组的NO水平高于空白组，表明造模使大鼠体内NO水平升高，从而加速炎症反应。与模型组比较，褐藻糖胶组、柠檬酸钾组和东哥阿里提取物组实验大鼠血清NO水平显著降低(P＜0.01)。模型组的5-HT高于空白组，表明以尿酸钠结晶复制痛风性关节炎的方法造成实验大鼠关节炎模型并引起痛感，与模型对照组比较，东哥阿里提取物组实验大鼠血清5-HT水平显著降低(P＜0.01)，推断其对本模型中炎症相关痛感有缓解作用。

表1 实验大鼠血清炎症细胞因子比较Table 1 Comparison of Inflammatory cytokines in Experimental tats serum

总之，褐藻糖胶、柠檬酸钾和东哥阿里提取物三种活性物质均能显著(P＜0.01)降低NO的水平，东哥阿里提取物可以同时显著(P＜0.01)降低IL-1β、IL-8、NO和5-HT的水平，对上述炎症因子的生成有抑制作用。

炎症的发生多表现为红、热、肿、痛和功能障碍的特征，本实验中褐藻糖胶、柠檬酸钾和东哥阿里提取物对关节注射尿酸钠引起的关节肿胀有显著(P＜0.01)抑制作用，推测三者对相关炎症有缓解或抑制的效果;结合该推断进行了髓过氧化物酶(MPO)、白介素、NO的检测发现三者均可以降低血清MPO和NO的水平。MPO是中性粒细胞的功能标志和激活标志，是中性粒细胞所特有，其水平及活性变化代表着嗜中性多形核白细胞(Neutrophilic polymorphonuclear leukocytes，PMN)的功能和活性状态，即使在有强吞噬作用的巨噬细胞中也极少或完全没有这种酶。在细胞化学上，一般将MPO作为中性粒细胞的标志。其功能为将氯氧化物和氧化氢转变为次氯酸盐。在炎症状态下，它被释入细胞外液，此酶参与含低密度脂蛋白的脂类氧化。PMN介导的炎症是痛风性关节炎的核心所在，而增强的中性粒细胞-内皮细胞黏连，是急性痛风产生的本质。循环中的PMN正常情况下呈非活化状态，在趋化因子和激活因子作用下可被激活，继而侵入炎症组织，引起组织损伤。激活因子通过与PMN细胞膜表面受体相结合，诱导PMN的呼吸爆发，激活的PMN在趋化因子作用下与血管内皮细胞(Vascular endothelial cells，VEC)粘附并进入组织中，PMN粘附并穿越VEC向炎症部位游走，是急性炎症损伤过程的重要特征，PMN与VEC表面粘附因子的相互作用是其分子生物学基础［6］。越来越多的证据表明［7-10］痛风性关节炎的核心是中性粒细胞介导的炎症，在正常情况下组织中少见PMN，组织中PMN较循环中PMN重要，一般循环中PMN是非活化状态，必须在趋化因子和激活因子作用下被激活，继而侵入炎症组织引起组织损伤并在组织损伤中起重要作用［11］。NO的合成和释放可以促进炎症反应，促进血管扩张，增强血管通透性，水肿，产生细胞毒性等，研究认为急慢性炎症的发生均与体内NO含量升高有关系。东哥阿里提取物组实验大鼠MPO和NO血清中含量的降低，提示痛风性关节炎症的红肿表现及功能障碍的抑制机制与NO的调控和中性粒细胞的激活密切相关。

IL-1β是在PMN趋化、激活过程中起重要作用的炎症细胞因子，是炎症反应的重要调节剂［12］。IL-1β作为调节炎症的始动因素，可增高微血管壁的通透性和炎性细胞趋化作用，激活炎性细胞，导致炎症反应加重或发展，并可诱导IL-6、IL-8等二级前炎症细胞因子。在痛风性关节炎的发生发展过程中，各个细胞因子非单独作用，而是结合成网络共同参与，互相影响。IL-1β主要由单核巨噬细胞产生，多存在于血及组织液中，可以诱导血管内皮细胞表达细胞黏附因子，活化巨噬细胞及粒细胞，刺激单核-巨噬细胞等合成IL-1、IL-6、IL-8及肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor，TNF-α)等。IL-8生物学活性主要是趋化中性粒细胞、嗜酸(碱)性粒细胞、淋巴细胞等到炎症局部引起炎症或变态反应。另外，IL-8还能激活PMN、嗜碱性粒细胞，扩张血管，促进血管增生及粒细胞增生，是一个有效的PMN激活和趋化因子。因而，实验中发现模型组与空白对照组的肿胀、肢体功能和MPO水平与上述白介素水平呈正相关性，而摄入东哥阿里提取物的实验大鼠血清中IL-1β和IL-8水平降低也与肢体肿胀、功能障碍及中性粒细胞活性的减轻密切相关。

急性痛风性关节炎的主要表现为关节疼痛，尿酸钠溶液引起的实验性痛风性关节炎模型主要表现为痛觉高敏及出现疼痛反应伴随肢体功能障碍。中枢5-HT和外周5-HT分属两个独立系统，在外周5-HT属致痛物质，在中枢5-HT属镇痛物质，实验中主要测定了血液中的5-HT，属于致痛物质，此指标的升高指征实验动物的痛感增强，反之则痛感降低。本实验中检测了实验大鼠血清5-HT的水平，结果如表1所示。模型组的5-HT高于空白组，表明以尿酸钠结晶复制痛风性关节炎的方法造成实验大鼠关节炎模型并引起痛感，与模型对照组比较，东哥阿里提取物组实验大鼠血清5-HT水平显著降低(P＜0.01)，推断其对本模型中炎症相关痛感有缓解作用，结合步态积分进行分析，发现东哥阿里提取物可以降低尿酸钠结晶造成的关节炎的痛感和对肢体正常功能的影响。

经比较可知，在褐藻糖胶、柠檬酸钾和东哥阿里提取物三种天然活性物质中，东哥阿里提取物可以有效缓解和抑制尿酸钠结晶引起的痛风性关节炎，对其临床表现出的关节肿胀、患处疼痛和肢体功能障碍有较好的缓解作用，并且初步推断其作用机制与通过抑制血清中炎症因子IL-1β、IL-8、NO和5-HT的增高从而降低中性粒细胞的活化和向患处趋化的几率密切相关。

1 Shi XY(施雪筠).Physiology(生理学).Beijing:Chinese Medicine Press，2001.105.

2 Zhu J(朱君)，Yu JW(余俊文).The advances in epidemiological and risk factors study on gout and hyperuricemia.Progress in Modern Biomedicine(现代生物医学进展)，2008，8:191.

3 Schumacher HR Jr.Febuxostat:A non-purine selective inhibitor of xanthine oxidase for the management of hyperuricaemia in patients with gout.Expert Opin Investig Drugs，2005，5:893-903.

4Chen WZ(陈文照)，Gu HP(谷焕鹏)，Wen CP(温成平).The effect of Tongfengning on IL-1，IL-6 content in synovial of gout arthritisrats.China J Chin Tradit Med Pharm (中国医药学报)，2004，19:93-94.

5 Coderre TJ，Wall PD.Ankle joint urate arthritis in rat:provide a useful tool for the evaluation of analysis and antiarthritis agents.Pharmacology Biochemistry and Behavior，1988，29 (03):46.

6 Lee J，An J，Yang HJ，et al.Reparatory and Preventive Effects of Oriental Herb Extract Mixture(OHEM)on Hyperuricemia and Gout.Food Sci Biotechnol，2010，19:517-524.

7 Pollmann G，Kullich W，Klein G.Therapy of hyperuricemia and gout.Wien Med Wochenschr，1997，147:382-387.

8 Terkeltaub R，Baird S，Sears P，et al.The murine homolog of the interleukin-8 receptor CXCR-2 is essential for the occurrence of neutrophilic inflammation in the air pouch model of acute urate crystal-induced gouty synovitis.Arthritis Rheum，1998，41:900-909.

9 Weinberger A.Gout，uric acid metabolism，and crystal-induced inflammation.Curr Opin Rheumatol，1995，7:359-363.10 Araki M.The role of E-selection for neutrophil activation and tumor metastasis in vivo.Leukema，1997，11(suppl3):209-212.

11 Chen GL(陈光亮).Effects and mechanisms of total saponin of Dioscorea and Achyranthes on gout.Anhui:Anhui Medical University(安徽医科大学)，PhD.2004.

12 Zhu XX(朱萱萱)，Chen Z(陈震)，Ji W(纪伟)，et al.The experimental study on Hot Bi Xiao treating acute gouty arthritis.Drug standard of China(中国药品标准)，2002，3:57.

Effects of Several Natural Extracts on Gouty Arthritis in Rats

SHI Shen1，2，3，4，5*，HE Wei4，5，XU Hong-mei4，5，LI Sen4，5，ZHANG Wei-rui1，2，ZHANG Ze-sheng3，4，51Tiens Group Co.Ltd，Post-doctoral workstation;2Tianjin Tiens Academy of Life Science and Technology，Tianjin 301700，China;3Tianjin University of Science and Technology，Post-doctoral mobile station;4Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education，Tianjin University of Science and Technology;5Department of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China

Gouty arthritis is one of the most painful symptoms of gout patients.This research aimed to investigate the effect of several natural extracts on acute gouty arthritis in rats induced by monosodium urate(MSU)crystals.The animal model of acute gouty arthritis on wistar rats was made through injecting MSU in ankle joints.The rats were administrated orally with Fucoidan，Potassium Citrate and Tongkat Ali extracts.And the joint swelling，gait score and several inflammatory factors in serum were measured to discuss the prevention and relief effects in the inflammation-related limb swelling，pain，dysfunction of the natural extracts on acute gouty arthritis and investigated the mechanism preliminarily.As a result，the three kinds of natural extracts could significantly reduce the joint swelling after induction MSU in rats 24 h later.This showed that the three could inhibit the symptoms inflammation-related limb joint swelling.Tongkat Ali extracts could decrease the gait score.It means that the limb inflammation，pain and dysfunction had been reduced on the rats.Anti-inflammatory mechanisms of the three active substances were explored，by further testing of experimental rat serum biochemical indices.Fucoida and Tongkat Ali extracts could significantly reduce the level of Myeloperoxidase.It indicated that both the mitigation of the inflammatory response may be related to the activation of neutrophils.And Tongkat Ali extracts could significantly decrease the IL-1β，IL-8，NO and 5-HT of model rats.It showed that Tongkat Ali extracts had a certain inhibitory effect on the occurrence，development and other aspects of inflammation，while the symptoms of limb dysfunction was reduced by inhibiting the pain related inflammatory factor such as 5-HT.In conclusion，the three kinds of natural extracts can relieve the attack of acute gouty arthritis induced MSU in rats.And the Tongkat Ali extracts play an important role in reducing the joint swelling，relieving the pain and the inhibition of inflammation.

uric acid;urate arthritis;fucoidan;potassium citrate;Tongkat Ali;rat

1001-6880(2012)10-1362-06

2011-12-22 接受日期:2012-05-25

*通讯作者 E-mail:shishen1030@163.com

R284.2

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