应用高速逆流色谱分离桑枝酚类成分

罗 隽，孙培文，刘 韶*，李新中*

1中南大学湘雅医院药剂科，长沙410008;2中南大学药学院，长沙410010

应用高速逆流色谱分离桑枝酚类成分

罗 隽1，2，孙培文1，2，刘 韶1，2*，李新中1，2*

1中南大学湘雅医院药剂科，长沙410008;2中南大学药学院，长沙410010

建立了高速逆流色谱(HSCCC)分离制备高纯度的桑枝酚类成分的新方法。分离条件如下：溶剂系统为正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶1∶1∶2，v/v)，上相为固定相，下相为流动相;流速2.0 mL/min;转速900 rpm;进样量75 mg。收集得到三个高纯度化合物，经HPLC、MS、1H和13C NMR等分别鉴定为反式氧化白藜芦醇(25.2 mg)，反式白藜芦醇(7.4 mg)和桑辛素M(29.1 mg)。高速逆流色谱可以高效分离桑枝成分，方法简便，技术可行，优于传统的柱色谱法。

HSCCC;桑枝;酚类;氧化白藜芦醇;白藜芦醇;桑辛素M

桑枝Ramulus mori.为桑科植物桑Morus alba L.的干燥嫩枝，临床上可用于类风湿性关节炎、高血压、高血脂等多种疾病的治疗，另有抗黑色素生成、抗氧化作用，其中主要的活性成分就是酚类化合物［1，2］。现有关于桑枝化学成分的研究较多，但一般采用柱色谱进行分离纯化［3-5］，分离周期长，操作过程复杂，而且重现性不好。

高速逆流色谱(High-speed Counter-current Chromatography，HSCCC)是一种不使用固相支撑体或载体的液液分配色谱技术，不仅分离时间短，费用低，还避免了固相载体带来的样品预处理要求高和不可逆吸附带来的样品损失、失活变性等，因而在植物有效成分的分离与提纯方面得到了广泛的应用［6］。为获得桑枝中高纯度的单体化合物，我们应用HSCCC分离技术对桑枝提取物进行了分离纯化，得到了至少三种酚类化合物。

1 仪器与材料

1.1 仪器

TBE-300A高速逆流色谱仪(上海同田生化技术有限公司);ÄKTA prime泵及紫外检测系统(美国GE公司);HX21050恒温器(北京博医康实验仪器有限公司);Agilent-1100型高效液相色谱仪;INOVA-400核磁共振仪(美国Varian公司);HCT型离子阱质谱仪(德国Bruker公司)。

1.2 材料

聚酰胺(80～100目，浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂);聚酰胺薄膜(5×10 cm，浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂);超纯水;甲醇(色谱纯，TEDIA COMPANY，INC.);其余试剂为分析纯。桑枝饮片(产地湖南，批号2009081404，湖南振兴中药饮片厂加工，由湘雅医院药剂科刘韶副教授鉴定为桑的干燥嫩枝(Ramulus mori.)。

2 实验方法

2.1 粗提物的制备

1 kg桑枝用70%的乙醇回流提取两次，第一次8000 mL，提取时间为2 h，第二次6000 mL，提取时间为1 h，合并提取液，减压浓缩至500 mL。将部分浓缩液(约120 mL，预先拌样)加到装有150 g预处理过的聚酰胺的层析柱(95 cm×4 cm，i.d.)上，分别用水、30%乙醇、60%乙醇、95%乙醇洗脱，将95%乙醇洗脱液减压浓缩至干，得到固体430 mg (待分离样品)，置干燥器内保存，备用。

2.2 HSCCC方法

2.2.1 两相溶剂系统及样品溶液的制备

HSCCC溶剂系统为正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶1∶1∶2，v/v)，将其按比例配制混合于分液漏斗中并剧烈震荡，分相平衡后分离出上下相并分别超声脱气，备用。另称取75 mg粗提物，加入上下相各5 mL，振荡使之完全溶解，备HSCCC分离。

2.2.2 分配系数K值的测定

从溶剂系统中各取等量上下相溶剂置于试管中，加入适量桑枝提取物，震荡混匀，静置分层后分别采用2.3中HPLC条件检测，观察各成分在两相溶剂中的分配情况。分配系数K=CS/CM，其中CS指溶质在固定相中浓度，CM指溶质在流动相中浓度，两者之比等于HPLC中峰面积之比，即K=AS/ AM。适宜的两相溶剂体系应是组分的分配系数K在0.5～2之间，该方法可用来进行溶剂系统的筛选。

2.2.3 HSCCC分离

开启泵，以最大流速将固定相泵入HSCCC色谱分离柱中至满，开启柱温箱升温至25℃，同时打开主机，选择主机旋转方向为正转，缓慢调节速度由低至高直达900 rpm，保持平稳旋转，以2.0 mL/min流速泵入流动相，待流动相从出柱口流出，两相系统在柱中已经建立动态平衡后开始进样。将样品溶液通过进样环注入主机管路，280 nm下检测，接收流分。

2.3 HPLC分析

应用该HPLC色谱条件筛选溶剂系统并比较HSCCC中流分的纯度和出峰时间。色谱柱为Ultimate XB-C18column(5 μm，250 mm×4.6 mm i.d.)，(Welch，America)，柱温30℃，检测器为紫外检测器，检测波长为285 nm，流动相为甲醇-水梯度洗脱，洗脱程序为：0～10 min，30%～40%MeOH;10～20 min，40%～60%MeOH;20～25 min，60%MeOH，进样体积为10 μL，流速1.0 mL/min。用面积归一化法判定含量。

3 结果与讨论

3.1 HSCCC分离条件的优化

3.1.1 溶剂系统的优化

备选溶剂系统有正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水①(1∶1.5∶1∶2，v/v)、②(1∶0.5∶1∶2，v/v)、③(1∶1∶1∶2，v/v)、④(1∶0.9∶1∶2，v/v)。通过分配系数K值的测定，溶剂系统①的K值过大，不仅耗时长且分离度也没有得到很好的改善;溶剂系统②K值过小，出峰时间太快，各峰分离度较差;溶剂系统③和④的K值在最佳范围内，但溶剂系统③的分离度和峰形较好，分离效果最优，因此选择③正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水(1∶1∶1∶2，v/v)作为本实验分离纯化的溶剂系统。

3.1.2 其它参数的优化

分别对转速(850 rpm，900 rpm)和进样量(50 mg，75 mg，100 mg)进行了优化。结果表明，转速较高时能提高固定相保留率，保证好的分离效果;进样量增加可以提高实验效率，但进样量为100 mg时，固定相保留率降低且分离效果也下降很多。因此选用转速为900 rpm和进样量为75 mg的条件。

3.2 HSCCC分离制备结果

图1 高速逆流色谱图(正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水=1∶1∶1∶2)Fig.1 HSCCC chromatogram(n-hexane∶ethyl acetate∶methyl∶water=1∶1∶1∶2)

采用溶剂系统为正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶1∶1∶2，v/v)，上相为固定相，下相为流动相;流速2.0 mL/min;转速900 rpm;进样量75 mg的条件进行分离，结果固定相保留率为71%，分离时间为180 min，根据HSCCC图谱(图1)手动分段收集得到五个组分(Ⅰ-Ⅴ)，分别减压浓缩干燥，称重分别为25.2、2.1、7.4、29.1和3.6 mg。

3.3 HPLC分析

采用2.3中HPLC条件对桑枝待分离样品及组分Ⅰ-Ⅴ分别进行检测(图2)。由图可知，组分Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ有显著的单一峰现象出现，用面积归一化法得到组分Ⅰ和Ⅳ的峰纯度为97%，组分Ⅲ的峰纯度为90%(重结晶后纯度为95%)，组分Ⅴ的峰纯度为87%，组分Ⅱ中峰比较多，后分段接收该部分也没有得到纯峰，故暂时不考虑该组分。

图2 待分离样品及其HSCCC分离后五个组分的HPLC图谱Fig.2 HPLC chromatograms of the sample under HSCCC separation and its five fractions

3.4 结构鉴定

将HSCCC分离得到的组分Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ进行理化性质和MS、1H和13C NMR等的检测，各组数据和结果如下：

组分Ⅰ：淡黄色无定形粉末(MeOH)，在聚酰胺薄膜上显蓝色荧光，与FeCl3试剂反应呈紫色，推测可能为酚类化合物。APCI-MS m/z：243［MH］-;1H NMR(DMSO-d6，400 MHz)δ：9.58(1H，s，OH-2)，9.40(1H，s，OH-4)，9.15(2H，s，OH-3'，5')，7.34(1H，d，J=8.4 Hz，H-6)，7.14(1H，d，J=16.8 Hz，H-α)，6.76(1H，d，J=16.4 Hz，H-β)，6.33(3H，br s，H-2'，4'，6')，6.23(1H，dd，J=8.4，2.0 Hz，H-5)，6.07(1H，t，J=1.8 Hz，H-3);13C NMR(DMSO-d6，100 MHz)δ：158.5(s，C-3'，5')，158.1(s，C-4)，156.0(s，C-2)，140.0(s，C-1')，127.1(d，C-6)，124.6(d，C-β)，123.2(d，C-α)，115.2(s，C-1)，107.2(d，C-5)，104.0(d，C-2'，6')，102.5(d，C-4')，101.3(d，C-3)。以上数据与文献［7，8］报道的氧化白藜芦醇的光谱数据基本一致，故确认化合物分子式为C14H12O4，且 H-α和 H-β的耦合常数 J=16.4 Hz，表明两个氢为反式构型，所以确定该化合物为反式氧化白藜芦醇(trans-oxyresveratrol)，化学结构式见图3。

组分Ⅲ：淡黄色无定形粉末(MeOH)，在聚酰胺薄膜上显浅蓝色荧光，与FeCl3试剂反应呈紫色，推测可能为酚类化合物。APCI-MS m/z：227［MH］-;1H NMR(DMSO-d6，400 MHz)δ：9.56(1H，s，OH-4)，9.20(2H，br s，OH-3'，5')，7.35(2H，d，J= 8.6 Hz，H-2，6)，6.97(1H，d，J=16.2 Hz，H-α)，6.78(1H，d，J=16.2 Hz，H-β)，6.72(2H，d，J=8.6 Hz，H-3，5)，6.35(2H，d，J=2.0 Hz，H-2'，6')，6.13 (1H，d，J=2.0 Hz，H-4');13C NMR(DMSO-d6，100 MHz)δ：158.2(s，C-3'，5')，157.4(s，C-4)，139.1 (s，C-1')，128.2(d，C-β)，127.9(d，C-2，6)，127.4 (s，C-1)，125.6(d，C-α)，117.1(d，C-3，5)，104.9 (d，C-2'，6')，102.5(d，C-4')。以上数据与文献［8］报道的白藜芦醇的光谱数据基本一致，故确认化合物分子式为C14H12O3，且H-α和H-β的耦合常数J =16.4 Hz，表明两个氢为反式构型，所以确定该化合物为反式白藜芦醇(trans-resveratrol)，化学结构式见图3。

组分Ⅳ：黄色无定形粉末(MeOH)，在聚酰胺薄膜上显蓝色荧光，与FeCl3试剂反应呈紫色，推测可能为酚类化合物。APCI-MS m/z：241［MH］-;1H NMR(DMSO-d6，400 MHz)δ：9.59(1H，s，OH-6)，9.46(2H，br s，OH-3'，5')，7.38(1H，d，J= 8.0 Hz，H-4)，7.08(1H，br s，H-7)，6.92(1H，s，H-3)，6.74(1H，dd，J=8.4，2.0 Hz，H-5)，6.68(2H，d，J=2.0 Hz，H-2'，6')，6.21(1H，t，J=2.0，H-4');13C NMR(DMSO-d6，100 MHz)δ：158.8(s，C-3'，5')，155.7(s，C-7a)，155.2(s，C-6)，153.9(s，C-2)，131.6(s，C-1')，121.1(d，C-4)，120.7(d，C-3a)，112.4(d，C-5)，102.6(d，C-3)，102.2(d，C-2'，6')，101.5(d，C-4')，97.4(d，C-7)。以上数据与文献［7］报道的桑辛素M的光谱数据一致，故确认分子式为C14H10O4，该化合物为桑辛素M(moracin M)，化学结构式见图3。

图3 三种酚类化合物的化学结构Fig.3 Chemical structures of three phenol compounds

组分Ⅴ：浅黄色无定形粉末(MeOH)，在聚酰胺薄膜上显淡蓝色荧光，与FeCl3试剂反应呈紫色，表明可能为酚类化合物。另经反式白藜芦醇365 nm照射实验推测该化合物可能为顺式白藜芦醇(cisresveratrol)，图4为反式白藜芦醇在365 nm下照射10 min后的HPLC图谱，其新生成物质的保留时间与组分Ⅴ的基本一致，且紫外扫描图也与组分Ⅴ及文献报道的顺式白藜芦醇的光谱图一致［9］。因该组分量太少且纯度较低，不利于纯化，故没有进行MS、1H和13C NMR的检测。

图4 反式白藜芦醇在365 nm照射后的HPLC图谱Fig.4 HPLC chromatography of trans-resveratrol after exposure to 365 nm ray

4 小结

以往对桑枝成分的分离多采用传统的柱色谱法，硅胶，Sephadex LH-20及RP-18等多种填料的色谱柱反复交互使用，不仅操作繁琐，而且文献中往往没有体现柱色谱分离的具体参数，他人无法重现其实验。而HSCCC操作简单，周期短，不需要任何固态载体，避免了不可逆吸附，且分离条件及相关参数明确，保证了良好的重现性，且用该法分离得到的高纯度酚类化合物可作为对照品用于桑枝的质量控制研究。

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Separation of Phenols from Ramulus mori.by High-Speed Counter-Current Chromatography

LUO Jun1，2，SUN Pei-wen1，2，LIU Shao1，2*，LI Xin-zhong1，2*1Department of Pharmacy，Xiangya Hospital，Central South University，Changsha 410008，China;2School of Pharmacy，Central South University，Changsha 410010，China

A new method was developed for the separation and purification of phenols by high-speed counter-current chromatography(HSCCC)from extract of Ramulus mori.The separation condition was determined as follows：n-hexane：ethyl acetate：methyl：water(1∶1∶1∶2，v/v)as the solvent system，the upper phase as the stationary phase，the lower phase as the mobile phase，2.0 mL/min of flow-rate，900 rpm of rotation speed，and 75 mg of injection amout.Transoxyresveratrol(25.2 mg)，trans-resveratrol(7.4 mg)，and moracin M(29.1 mg)were obtained and identified by HPLC，MS，1H and13C NMR.It indicated that HSCCC can be used for separating the active compounds of Ramulus mori efficiently and exhibited many advantages compared with the column chromatography method.

HSCCC;Ramulus mori.;phenols;oxyresveratro1;resveratrol;moracin M

1001-6880(2012)04-0486-04

2010-10-11 接受日期：2011-03-07

*通讯作者 Tel：86-731-84327454;E-mail：Xylixin@medmail.com.cn; liushao999@hotmail.com

R284.2

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