东北红豆杉多糖的化学研究

姜瑞芝，姜翔之，曹传英，陈英红，王 颖，高其品

1吉林省中医药科学院，长春130012;2吉林大学中日联谊医院;3吉林大学;4长春中医药大学研发中心，长春130021

东北红豆杉多糖的化学研究

姜瑞芝1，姜翔之2，曹传英3，陈英红1，王 颖1，高其品4*

1吉林省中医药科学院，长春130012;2吉林大学中日联谊医院;3吉林大学;4长春中医药大学研发中心，长春130021

利用水提醇沉提取东北红豆杉多糖TP，经超滤得到超滤外液TP-1和内液TP-2。TP-2进行部分酸水解和凝胶柱层析分离纯化，得到TP-2-1a。通过对理化性质、分子量、单糖组成和甲基化测定结果分析，确定其分子量分布在7.0 kDa左右，糖组成由Rha、Man、Gal、Glu、GalA和GlcA构成，摩尔比为：16.9∶1.0∶15.5∶1.3∶9.9∶2.5，中性糖以Gal的1→3、1→4连接为主，在1→3连接的O-6位上有分支;Rha以1→2连接为主，在O-4位上有分支;Man以1→4、1→6连接为主;Glu以1→3、1→4连接为主;非还原末端主要是Gal及少量的Man、Glu和Rha。酸性糖以1→4连接GalA为主，无分支。该多糖为首次从东北红豆杉中分离得到。

东北红豆杉;多糖;HPLC;GC-MS

东北红豆杉(Taxus cuspidate)，又称紫杉，为珍稀药用资源。1971年，美国科学家首次从该属植物中分离得到的紫杉醇被证明具有显著的抗肿瘤活性［1］，随后对其进行了大量的研究，得到了400多种紫杉烷类化合物［2，3］。近10年来，该属植物中的多糖类化合物的药理活性逐渐引起了人们的关注［4，5］，但相关化学研究甚少，尤其在多糖的化学结构方面尚未见报道。本实验从东北红豆杉的地上部分提取分离了糖蛋白部分，并确定了糖部分的理化性质和化学结构。

1 材料和方法

1.1 试剂与仪器

东北红豆杉地上部分为本实验室采集。标准品牛血清白蛋白(ABS)、葡萄糖(Glc)、鼠李糖(Rha)、岩藻糖(Fuc)、阿拉伯糖(Ara)、木糖(Xyl)、甘露糖(Man)、半乳糖(Gal)、半乳糖醛酸(GalA)、葡萄糖醛酸(GlcA)均购自Sigma公司，纯度为99%。1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)等试剂均为国产分析纯。

752紫外分光光度计为上海精密科学仪器有限公司产品;LC-2010高效液相色谱仪为日本岛津公司产品，Diamonsil C18柱(Φ4.6 mm×250 mm); 10AT-VP高效液相色谱仪，示差折光检测器为日本岛津公司产品，OHpaK SB-804HQ凝胶色谱分析柱(Φ8 mm×300 m)，GPC软件;中空纤维超滤系统为北京旭邦膜设备有限责任公司产品;气质联用仪(GC-MS)为Trace-MS美国FINGAN。

东北红豆杉地上部分由吉林省中医药科学院资源所徐国经副教授鉴定为Taxus cuspidate。

1.2 实验方法

1.2.1 TP、TP-1、TP-2的提取分离

东北红豆杉地上部分50 kg，剪碎，加12倍量水煎煮三次，每次3 h，提取液浓缩，加乙醇至醇浓度70%，静置过夜，离心，沉淀加少量水溶解，冻干，得TP 320 g。

取TP 200 g，加水溶解，经中空纤维柱超滤(截留分子量为10 K)，得超滤液(TP-1)和浓缩液(TP-2)两部分，浓缩冻干，分别得39 g和82 g。

1.2.2 TP-1和TP-2分子量测定

采用HPLC凝胶柱色谱法，以标准葡萄糖Dextran T系列制作标准曲线(流动相：0.7%Na2SO4溶液，流速为0.5 mL/min，柱温35℃)，样品同行，利用GPC软件计算其分子量。

1.2.3 TP-1和TP-2中无机元素组成及含量

采用ICP法测定TP-1和TP-2中无机元素组成及含量。

1.2.4 TP-1对蒸馏水透析

对TP-1进行蒸馏水透析(截流分子量3000)，透析内液浓缩，冻干得TP-1a。

1.2.5 TP、TP-1、TP-2和TP-1a理化性质测定

采用lowry法［6］(以牛血清白蛋白为标准品)、间羟基联苯法［7］(以半乳糖醛酸为标准品)、苯酚-硫酸法［8］(以半乳糖为标准品)测定蛋白质、糖醛酸及中性糖的含量。

1.2.6 糖醛酸对中性糖含量测定的干扰［9］

配制GalA标准溶液浓度为248 μg/mL，按照苯酚-硫酸法制作糖醛酸的标准曲线。

1.2.6.2 排除酸性糖干扰的中性糖含量测定

移取一定量的样品，计算出其所含糖醛酸质量数，并代入苯酚-硫酸法测定以糖醛酸为标准品制作的标准曲线，计算其吸收值(记作A1)。苯酚-硫酸法测得的相同取样量的吸收值(记作A0)，减去A1后代入苯酚-硫酸法测定以半乳糖醛酸为标准品制作的标准曲线，计算其含量。

1.2.7 TP-2的部分酸水解

取TP-2 5 g加0.9%硫酸50 mL，95℃恒温水浴3 h，加BaCO3中和，离心，取上清液加入五倍的乙醇，离心，分别得沉淀TP-2-1和上清TP-2-2。

1.2.8 TP-2-1和TP-2-2的分子量测定

按实验1.2.2方法操作。

然而，时刻保持对世界的善意，对每一个人的理解与包容，几乎每一天，我都在内心进行自我教育。也相信，每一个，尤其是身边人，也都会如此。事实上我错了，我们周边人心的繁复与幽深，温良与狂躁，古老而新鲜的恶，尤其是不自觉的恶意，就像是隐藏的匕首和投枪，时不时锃亮出鞘，狠狠地将我们教育一次。由此我也再一次认为，其实善恶原本都是天性中携带的，只不过，有些人因为后天文化修养，特别是在世事洞明之后觉醒了，进而内心和精神当中，饱含诚挚与善意；而另一些人，则在现实生活中，由于自己的不够强大，而生怕失去了眼前既有的利益，遭遇对自己不利的情况，雷光电火，顷刻爆发。

1.2.9 TP-2、TP-2-1、TP-2-2的单糖组成分析［10］

取标准品单糖溶液(2 mmol/L)各5 mL，各加6 mL 0.5 mol/L PMP甲醇溶液，加5 mL 0.3 mol/L NaOH，70℃水浴0.5 h，加5 mL 0.3 mol/L HCL中和，用等体积氯仿萃取3次，取水层放置过夜，制得标准单糖PMP衍生物。取样品各20 mg，加2 mol/L三氟乙酸2 mL，110℃水解12 h，放置室温，衍生化方法同上，制得样品PMP衍生物，分别取标准品和样品PMP衍生物进行单糖组成分析。

高效液相色谱条件：Diamonsil C18柱，柱温：40℃，流动相：A-磷酸缓冲液(pH=6.8)：乙睛(85∶15，V/V);B-磷酸缓冲液(pH=6.8)：乙睛(60∶40，V/ V)，流速：0.9 mL/min，波长：250 nm。进样量10 μL。

1.2.10 TP-2-1的分离纯化

取TP-2-1 300 mg，溶于30 mL蒸馏水中，上Sephadex G-75柱(Φ2.5 cm×120 cm)，用蒸馏水洗脱，部分收集器收集7 mL/管。间管用苯酚-硫酸在A490nm处监测。以收集的管数为横坐标，以糖的吸收值为纵坐标绘制吸收曲线。根据吸收曲线图形分得到两部分TP-2-1a和TP-2-1b，冻干，分别得186 mg和45 mg。

1.2.11 TP-2-1a的单糖组成分析

按实验1.2.7方法操作。

1.2.12 TP-2-1a的分子量测定

按实验1.2.2方法操作。

1.2.13 TP-2-1a的糖苷键连接方式分析

采用改良的Hakomori［11］和Valent［12］法，对TP-2-1a分别进行中性糖及酸性糖部分糖苷键连接方式分析。

2 结果与讨论

2.1 理化性质测定

东北红豆杉地上部分通过水提醇沉得到TP，理化性质测定结果为，总糖含60.39%，蛋白质含26.96%，收率为3.2%。利用中空纤维超滤将TP分为超滤外液TP-1和浓缩液TP-2两部分，收率分别为19%和42%，分子量各分布在1.5和20 kDa左右。理化性质结果显示，TP-1的总糖和蛋白质含量之和仅占总固体物的30%，通过ICP元素分析，TP-1和TP-2中无机元素分别占19.7%和3.0%，说明TP-1中含有大量的无机盐，经透析得到TP-1a，各样品的理化性质测定结果见表1。东北红豆杉多糖为酸性杂多糖，且酸性糖含量很高，由于酸性糖的存在，对中性糖的含量测定会产生很大的干扰，所以表1中在未排除干扰时所测的中性糖、蛋白质和糖醛酸含量之和超过100%，为使测定结果更真实，实验“1.2.6”为排除酸性糖干扰试验，标准曲线为Y= 4.2×10-3+1.02×10-3X，经测定与计算后，得出无干扰的中性糖含量(见表1)。

表1 各多糖样品理化性质测定结果Table 1 Physical and chemical properties of the polysaccharide samples

2.2 TP-2组成糖分析

实验对TP-2进行部分酸水解，经乙醇沉淀，分别得到沉淀TP-2-1和上清TP-2-2两部分，分子量分布在20-0.1 kDa和0.5-0.1 kDa之间，表明TP-2-1为多糖部分，TP-2-2为寡糖和单糖。组成糖结果表明，TP-2-1中主要含有Rha、Gal和GalA，表明TP-2的主链部分应由此3种单糖构成。TP-2-2中主要含有Ara，不含GalA和GlcA，说明TP-2的侧链或末端主要是Ara和少量的Man、Gal和Glc构成，酸性糖均存在于主链中。组成糖结果见表2。

表2 TP-2组成糖分析结果(各组成单糖摩尔比)Table 2 Results of sugar composition analysis of TP-2(molar ratio of monosaccaride composition)

2.3 TP-2-1a的单糖组成分析

实验利用Sephadex G-75凝胶柱层析对TP-2-1进行分离纯化，得到TP-2-1a、TP-2-1b两部分，收率分别为62%和9.2%，分子量测定结果为7 kDa和0.35 kDa，结果见图1。TP-2-1a的组成糖主要由Rha、Gal、GalA，及少量的Glu、Man和GlcA构成，其摩尔比6.9∶15.5∶9.9∶1.3∶1∶2.5，结果见图2。

2.4 TP-2-1a甲基化分析

甲基化结果表明，TP-2-1a的中性糖连接方式为：以Gal的1→3、1→4连接为主，在1→3连接的O-6位上有分支;Rha以1→2连接为主，在O-4位上有分支;Man以1→4、1→6连接为主;Glu以1→3、1→4连接为主;非还原末端主要是Gal，及少量的Man、Glu和Rha。结果见表3。

图3 MS中显示出GalA的分子离子峰，经氘代四氢铝锂还原后的m/z值要比相应中性糖片段的m/z值多2。MS中出现的235分子离子峰是GalA氘代特征峰，此峰确定GalA的连接方式为1→4连接。GlcA由于含量低，甲基化结果尚未确定。

表3 TP-2-1a甲基化分析结果Table 3 Methylation results of TP-2-1a

图3 TP-2-1a中GalA-6-D2的MS图Fig.3 MS of GalA-6-D2 from TP-2-1a

2.5 结论

东北红豆杉中含有丰富的多糖类化合物，实验中对TP的多糖部分通过部分酸水解、分离纯化及其理化性质、组成糖、糖苷键连接方式进行了系统研究，确定了TP糖部分的平均结构为：

其侧链(SC)为：1→3连接、1→4连接的Gal，且在1→3连接的Gal的6位上有分支;以及少量的1→4连接、1→6连接Man、少量的1→3连接、1→4连接Glu;非还原末端主要是Gal。该研究结果为今后进一步开发东北红豆杉大分子多糖奠定了基础。

1 Wang CL(王春霖)，Cao CM(曹聪梅)，Zhang ML(张嫚丽)，et al.Research progress in Taxanes compounds.Hebei Med J(河北医药)，2005，27：684-688.

2 Cao CM(曹聪梅)，Huo CH(霍长虹)，Zhao YM(赵永明)，et al.Studies on chemical constituents in heartwood of Taxus cuapidata.China J Chin Mater Med(中国中药杂志)，2006，31：1510-1513.

3 Cao CM(曹聪梅)，Li ZP(李作平)，Shi QW(史清文).Chemical constituents in Taxus cuspidate and their bioactivities.Nat Prod Res Dev(天然产物研究与开发)，2006，18：330-342.

4 Zhu TM(朱天民)，Zhu HM(朱慧民)，Li H(李辉).Taxus polysaccharides on Beagle dogs myocardial ischemia-reperfusion model of myocardial apoptosis and monocyte chemoattractant protein-1 and NO expression.Chin Tradit Herb Drugs (中草药)，2010，41：778-781.

5 Liu CL(刘春兰)，Yang Y(杨宇)，Li ZX(李转秀)，et al.Study on extraction and scavenging free radical activity of water soluble polysaccharide in cultivate taxus.J MUC(中央民族大学学报)，2009，18(2)：10-15.

6 Li JW(李建武)，Xiao NG(萧能赓)，Yu RY(余瑞元)，et al.Principles of biochemical experiments method(生物化学实验原理方法).Beijing：Beijing University Press，1994.160-176.

7 Blan KN，Asboe-Hansen G.New method for quantitative determination of uronic acids.Anal Biochem，1973，54：484-489.

8 He JQ(何佳奇)，Yao ZS(姚振生)，Xiong YK(熊耀康)，et al.Content determination of polysaccharide in Radix and Rootlet ophiopogonis by the method of phenylhydrate sulfuric acid.Chine J Inf Tradit Chin Med(中国中医药信息杂志)，2006，13(10)：51-52.

9 Yang YJ(杨勇杰)，Jiang RZ(姜瑞芝)，Chen YH(陈英红)，et al.Determinationof sugar in heteropolysaccharide by phenol-sulfuric acid method.Chin Tradit Pat Med(中成药)，2005，27：706-708.

10 Yang XB(杨兴斌)，Zhao Y(赵燕)，Zhou SY(周四元)，et al.Analysis of monosaccharide composition in Angelica polysaccharides by precolumn derivatization high performance liquid chromatography.Anal Chem(分析化学)，2005，33：1287-1290.

11 Hakomori S.A rapid permethylation of glycolipid，and polysaccharide catalyzed by methylsulfinyl cabanion in dimethyl sulfoxide.J Biochem，1964，55：205-208.

12 Kalyan RA，Paul BT.Acomprehensive procedure for preparation of partially methylated alditol acetates from glycoprotein carbohydrates.Anal Biochem，1992，203：101-108.

Chemical Analysis of Polysaccharides from Taxus cuspidate

JIANG Rui-zhi1，JIANG Xiang-zhi2，CAO Chuan-ying3，CHEN Ying-hong1，WANG Ying1，GAO Qi-pin4*1Jilin Province Academy of Chinese Medicine and Material Medica Science，Changchun 130012，China;2China-Japan Union Hospital of Jilin University;3Jilin University;4Center for New Medicine Research，Changchun University of Chinese Medicine，Changchun 130021，China

TP was obtained by water extraction and alcohol precipitation from Taxus cuspidate.TP was filtrated through a cellulose ultrafiltration system to give the extra-ultrafiltrate with TP-1 and intro-ultrafiltrate with TP-2.TP-2 was treated with partially acid hydrolysis，then purified by Sephadex G-75 column to obtain the polysaccharides TP-2-1a.TP-2-1a was studied，including the physical and chemical properties，molecular weight，sugar compositions，glycosidic linkage analysis and so on.The molecular weight of TP-2-1a was about 7.0×103 kDa.Suger compositions were Rha，Man，Gal，Glu，GalA and GlcA，in molar ratio of 16.9∶1∶15.5∶1.3∶9.9∶2.5.The backbone of TP-2-1a were(1→3)and(1→4)-linked galactosyl，(1→4)and(1→6)-linked mannosyl，(1→3)and(1→4)-linked glucosyl，and(1→4)-linked galacturonide，There were side chains attached to O-6 of(1→3)-linked galactoside and O-4 of(1→2)-linked rhamnoside.And the non-reducing terminals were mostly galactose and a few mannose，glucose and rhamnose.This is the first time to obtain the polysaccharides from T.cuspidate.

Taxus cuspidate;polysaccharides;HPLC;GC-MS

1001-6880(2012)04-0440-04

2011-05-31 接受日期：2011-12-23

*通讯作者 Tel：86-431-86058667;E-mail：gaoqipin@sina.com

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