景宁木兰花粉生活力测定

2012-11-24蒋燕锋许元科毛昌会

浙江林业科技 2012年5期

刘饶，蒋燕锋，许元科，毛昌会

（1.浙江省景宁县科技开发服务部，浙江景宁 323500；2.浙江省丽水市林业科学研究院，浙江丽水 323000；3.浙江省景宁县林业局，浙江景宁 323500）

景宁木兰（Magnolia sinostellata）是1984年发现、1989年定名的木兰属新种[1～2]。在生产实践中发现景宁木兰座果率和种子产量不高，严重影响了该珍稀濒危植物的大范围栽培和开发利用。植物受精成败受花粉活力、柱头生活力和环境温度、湿度等影响。花粉是遗传信息的载体，是自然条件下种子植物遗传信息交流的工具，其生活力直接影响植物授粉受精乃至座果[3]。其活力测定结果的准确性决定细胞学实验和杂交育种的成败，可为植物推广种植时授粉品种的遴选及生产中制定花期喷硼的促果技术提供依据。因此，花粉生活力测定方法及测定标准一直是育种关注的问题。

1 材料和方法

1.1 材料

试验材料为景宁木兰花粉，在景宁木兰花苞半开放期，选取树冠中上部阳面的健康花枝，在室内进行水培，待其花粉自然成熟时收集，于4℃的冰箱及室温下保存，备用。

1.2 实验方法

采用TTC法、过氧化物酶测定法及花粉发芽法测定景宁木兰花粉活力。TTC法、过氧化物酶测定法均观察3个制片，每片取3个视野；花粉发芽法每个处理观察3个视野，每个视野观察100粒。花粉萌发以其花粉管伸长超过花粉直径为标准，统计花粉发芽率，取平均值为结果。

2 结果与分析

2.1 景宁木兰花粉活力测定方法确定

利用TTC法进行花粉生活力的测定具有快速简便的特点，但是受到花粉自身因素的影响较大，例如花粉壁薄厚，花粉外壁的组成物质，花粉内各种酶活性等。因此，不同的染色方法只适合于某些植物花粉生活力的测定，不同的染色剂对同一品种的花粉染色率是不同的。景宁木兰花粉经0.5%TTC溶液染色之后，显现出淡红色居多。但是其颜色稳定性较差，染色效果不理想，并且有生活力和无生活力的染色界限不分明，表明TTC染色法不适合用于景宁木兰花粉生活力的测定。

试验中也观察到过氧化物酶测定法测定景宁木兰花粉生活力的效果不明显，其测定结果相对于花粉发芽法明显偏高。因此，进一步试验均以花粉离体培养法进行。

2.2 花粉离体萌发培养法测定景宁木兰花粉活力

2.2.1 最适宜观测时期的确定在景宁木兰花粉萌发速度和伸长速度达到稳定时进行花粉生活力数据的统计可以使统计数据更准确。为了探索景宁木兰花粉萌发速度及花粉管伸长速度达到稳定的时间点，本试验对其离体萌发情况进行了跟踪测定。结果表明，景宁木兰花粉培养2 h就开始萌发，10 h萌发率上升到了68.22%，其后萌发率缓慢增加，14 h达到了78.25%；14 ～ 16 h萌发率趋于稳定，花粉萌发逐渐停止。由此可见，进行花粉萌发率测定的最适合时间点是培养12 h以后。景宁木兰花粉培养12 h后，在显微镜下已可清晰辨认，14 h后彼此相互交错延伸，使花粉粒的统计变得越来越困难。所以，综合萌发率和伸长速度的变化情况，以花粉管培养14 h内进行数据统计最合适。

2.2.2 不同蔗糖浓度对景宁木兰花粉萌发的影响蔗糖对景宁木兰花粉萌发的影响见表1。从表中可以看出，景宁木兰花粉的萌发对培养基中的蔗糖浓度有较为严格的要求，有明显的域值效应。萌发率从高到低依次为蔗糖浓度5%，0%，10%，15%，20%。蔗糖浓度以5%时最为适宜，此时景宁木兰花粉的萌发率高达93.96%；低于5%的蔗糖浓度花粉萌发率与5%较为接近；然而蔗糖浓度 15%时反而不利于花粉的萌发，其萌发率降为17.41%；蔗糖浓度为20%时，花粉出现了明显的质壁分离现象，花粉不能萌发。

经方差分析表明，不同蔗糖浓度对景宁木兰花粉萌发率的影响差异显著，且花粉萌发率在蔗糖浓度5%时极显著高于其他4个浓度。该结果表明，蔗糖浓度过高时会抑制花粉的萌发，5%的蔗糖浓度对景宁木兰花粉的离体培养较为适宜。

2.2.3 不同硼酸浓度对景宁木兰花粉萌发的影响硼酸可增加氧的吸收以及促进糖的吸收和代谢，利于果胶的合成，因而对花粉的萌发起促进作用。表2结果显示，加入少量硼酸能够提高花粉的萌发率。随着硼酸浓度的增加，花粉的萌发率有所上升，当硼酸的浓度为 0.01%时，花粉的萌发率最高，达到86.64%。之后随硼酸浓度的增加，花粉的萌发率显著下降。由此可见，过量的外源硼对景宁木兰花粉的萌发有抑制作用。

方差分析表明，不同硼酸浓度对景宁木兰花粉萌发率的影响差异显著，且花粉萌发率在硼酸浓度 0.01%时极显著高于其他浓度。0%和0.03%硼酸浓度下萌发率差异不显著，该结果表明，低浓度的硼酸培养基有利于花粉的萌发，硼酸浓度过高时反而会抑制花粉的萌发，0.01%的硼酸浓度对景宁木兰花粉的离体培养较为适宜。

表1 不同蔗糖浓度下景宁木兰花粉的萌发率Table1 Pollen germination rate of M.sinostellata with different sucrose concentration%

表2 不同硼酸浓度下景宁木兰花粉的萌发率Table2 Pollen germination rate of M.sinostellata with different borax concentration%

2.3 温度与储藏时间对花粉生活力的影响

一般来说花粉的生活力会随着贮藏时间的增加而降低，不同的贮藏方法在保持花粉生活力方面会有所不同。为此对采集的景宁木兰花粉在室内常温贮藏和4℃冰箱冷藏保存条件下进行了生活力观察。

表3结果显示，4℃低温下储藏的景宁木兰花粉，其花粉发芽率高于室温下储藏的花粉。常温下，花粉在第16 ～ 20 d时，就基本上丧失了活力，而在4℃低温下，花粉的活力延长到了26 ～ 30 d，低温储藏10 d内，花粉活力≥75%。景宁木兰花粉无论是在常温还是 4℃低温条件下，从采集花粉的当天开始，花粉活力就开始下降。景宁木兰花粉在采集后的几天内，由于花粉刚脱离母体，失去了水分、营养等供应，贮藏的最初10 d内活力下降较快。室内常温贮藏10 d，其活力由93.95%下降到28.29%，每天下降6.57百分点；4℃冰箱冷藏保存10 d，花粉生活力由93.95%下降到78.55%，日平均下降 1.54百分点。实验结果表明，温度对景宁木兰的花粉活力有影响，4℃低温确实能使景宁木兰的花粉保持相对较高的活力，但是所能延长的时间并不久。

表3 不同温度和储藏时间对花粉发芽率的影响Table3 Effect of different temperature and storage duration on pollen germination rate%

3 讨论

3.1 TTC法和过氧化物酶测定法不适合景宁木兰花粉生活力测定

通过对测定结果的分析认为，TTC法测定景宁木兰花粉时其颜色稳定性较差，染色效果不理想，并且有生活力和无生活力的染色界限不分明，表明TTC染色法不适合用于景宁木兰花粉生活力的测定。过氧化物酶测定法测定景宁木兰花粉生活力的效果也不明显，测定结果相对于花粉发芽法明显偏高。

3.2 适宜的硼酸浓度可以促进花粉萌发

硼酸对于花粉的萌发和花粉管的伸长有一定的促进作用，是花粉离体萌发培养基的主要成分[4]。Jackson等人在以矮牵牛为试材的研究中也发现，在花粉管生长过程中，培养基内有硼酸时，有利于更多的蛋白质组装成膜和壁的成分，而膜和壁是花粉管生长的必须成分，因而有利于花粉管的生长。迄今有关硼酸对花粉萌发和花粉管生长的研究均认为，一定浓度的硼酸有利于花粉萌发和花粉管的生长[5]。但不同植物种类的花粉萌发和生长所需的最适硼酸浓度不同。研究结果表明，在添加硼酸的培养基内景宁木兰花粉萌发和花粉管生长均有所提高，但高浓度则起抑制作用，其最佳浓度为0.01%。

3.3 适宜的蔗糖浓度可以促进花粉萌发

蔗糖对花粉的萌发具有两方面作用，一是为花粉的萌发及花粉管的生长提供营养，二是维持外界环境一定的渗透压。蔗糖能进入花粉并增大细胞内已很高的内源浓度。所以，高浓度的蔗糖能改变花粉管的透性，导致代谢物和离子泄露在培养基里，反而对萌发不利。实验结果也表明了一样的结果，供试景宁木兰花粉萌发率随蔗糖浓度的增加而升高，在浓度为5%时，萌发率最高，大于5%时，萌发率随蔗糖浓度的增大而降低，蔗糖浓度15%时其萌发率降为19.55%，蔗糖浓度为20%时，花粉出现了明显的质壁分离现象，花粉不能萌发。