电针对吗啡依赖大鼠重要脏器组织细胞凋亡及Bax、Bcl－2蛋白表达的影响*

孙远征，马 俊，卫 哲，王明明

(1.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江哈尔滨150001;2.黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨150040)

对于长时间接触阿片类毒品的人来说，发生戒断综合征除了精神症状外，往往频繁出现器质性损伤后相应的临床表现，而且以循环系统、消化系统、泌尿系统功能障碍为主，严重者出现心衰、肝衰竭和肾衰竭，直接导致吸毒者生存质量的下降，进而对生命构成威胁，临床中致死病例较多。

吗啡进入机体后，经循环系统迅速分布于人体大多数组织中，包括实质性脏器、空腔脏器等。吗啡进入机体转化的主要部位是肝脏，同时肾脏等组织对吗啡也有代谢作用。吗啡和其代谢产物主要经肾脏随尿液排泄[1]。另外 Wenedy等[2]用 HPLC 检测方法证实急性染毒大鼠心脏组织吗啡浓度明显高于脑组织。相关尸检研究[3]证实因吗啡成瘾致死者心脏、肝脏、肾脏病理组织结构损伤明显。本实验通过观察电针对吗啡依赖大鼠模型行为学及其重要脏器组织的Bax和Bcl－2蛋白表达的影响，深入研究并探讨电针对吗啡依赖后心脏、肝脏、肾脏组织结构损伤的可塑性的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

SD大鼠40只，3～5月龄，体重(280±20)g，雄性，由黑龙江中医药大学提供。所有大鼠随机分为4组:对照组、模型组、手针组和电针组，每组10只。

1.2 主要试剂和仪器

盐酸吗啡注射液(沈阳第一制药厂)，盐酸纳洛酮注射液(成都倍特药业有限公司)，细胞凋亡检测试剂盒、Bax抗体、Bcl－2抗体(武汉博士德生物工程有限公司)，Envision试剂(DaKo公司)，KWD808Ⅱ脉冲治疗仪，LEICARM2145型石蜡切片机，BH2型OLYMPUS显微镜。

1.3 实验方法

1.3.1 吗啡成瘾模型的建立

大鼠适应性喂养1周后，参照文献[4]，随机取10只为对照组，与吗啡注射组相同时间、相同方法注射生理盐水，其余3组逐日递增法背部皮下注射盐酸吗啡注射液(20 mg/kg，30 mg/kg，40 mg/kg，50 mg/kg，50 mg/kg)，2 次/天(8 am，4 pm)，连续5 天。于末次注射吗啡后3 h给予纳络酮腹腔注射(3 mg/kg)快速戒断。

1.3.2 观察大鼠戒断症状

纳洛酮注射后1 h内，观察小鼠催促戒断出现的各种戒断症状，记录动物戒断症状分值，按改进的柳田知司评分标准[5]进行评分。分别为异常姿势(2分);高度激惹:触碰(1分)，靠近(2分);意向性震颤:间断性(1分)，连续性(2分);咬牙:间断性(0.5分)，连续性(1分);烦躁不安:轻度(0.5分)，明显(1分);流泪(4分);腹泻:软便(4分)，不成形(8分);流涎:轻度(1分)，明显(2分);体重减轻:2%(0分)，2% ～4%(5分)，4% ～6%(10分)，6% ～8%(15分)。然后将记录的数据相加。

1.3.3 实验动物处理

对照组:按上述方法造模，于第6天开始采用与电针组相同的方法固定，连续6天。

模型组:按上述方法造模，于第6天开始采用与电针组相同的方法固定，连续6天。

电针组:按上述方法造模，于第6天开始进行电针电针刺激百会、双侧心俞、肝俞、肾俞、足三里、三阴交穴，取穴方法依据《实验针灸学》相关内容，电针采用疏密波，频率2/100 Hz，强度以大鼠下肢轻微抖动为度，15 min/次，1 次/天，共6 天。

手针组:按上述方法造模，于第6天开始进行针刺治疗，取穴及针刺时间同电针组。

1.3.4 实验取材及标本制备

各组动物模型成功建立后，将动物麻醉，仰卧固定于手术台上，剪开胸壁暴露心脏，立即作左心室插管，先用生理盐水灌注，剪开右心房，同时打开腹腔暴露肝脏，至肝脏变白，约灌注20 min，再用4%多聚甲醛/0.1%DEPC灌流固定约40 min，取心脏、肝脏、肾脏组织，分别浸入固定液中，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，5 μm片厚连续切片，HE染色后光镜观察组织病理学变化。

1.3.5 检测方法

凋亡细胞的检测:根据试剂公司提供的试剂盒，按相关说明书进行，即TUNEL法检测，并进行图像分析。

组织凋亡相关基因Bax蛋白、Bcl－2蛋白免疫组织化学检测:采用EnvisionⅠ法检测，具体操作步骤依据试剂公司提供的试剂盒，按相关说明书进行，并进行图像分析。

1.3.6 统计学处理

随机选取3个视野，在微测框(5 mm×5 mm)内对相邻切片的TUNEL阳性细胞及Bax、Bcl－2阳性细胞进行计数，取平均值。采用SPSS17.0软件进行分析，计量资料用±s表示，采用单因素方差分析(one－way ANOVA)，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组吗啡依赖大鼠催瘾后戒断症状比较

在纳洛酮注射1 h后，模型组、手针组和电针组大鼠出现异常姿势、震颤、咬牙、烦躁、流泪等戒断症状较对照组明显，同时戒断症状评分结果显示模型组、手针组、电针组与对照组比较有显著差异(P＜0.01)，说明吗啡依赖模型建立成功。见表1。

表1 各组大鼠戒断症状评分(分，m±s)

2.2 各脏器HE染色结果

2.2.1 心脏 光镜下，对照组心肌细胞排列整齐，细胞质染色均匀，细胞核形态呈圆形或椭圆形，染色均匀，见图1;模型组心肌细胞排列紊乱，部分胞膜破裂，细胞核有固缩和肿胀现象，再者细胞核碎裂及溶解，出现无核区，染色不均匀，见图2;电针组与手针组心肌细胞排列较规整，胞质染色较模型组均匀，细胞核固缩、肿胀、碎裂及溶解现象较模型组明显减少，见图3、图4。

图1 对照组心脏组织HE染色×400

图2 模型组心脏组织HE染色×400

图3 电针组心脏组织HE染色×400

图4 手针组心脏组织HE染色×400

图5 对照组肝脏组织HE染色×400

图6 模型组肝脏组织HE染色×400

图7 电针组肝脏组织HE染色×400

图8 手针组肝脏组织HE染色×400

图9 对照组肾脏组织HE染色×400

图10 模型组肾脏组织HE染色×400

图11 电针组肾脏组织HE染色×400

图12 手针组肾脏组织HE染色×400

2.2.2 肝脏 光镜下，对照组肝小叶形态完整，肝索以中央静脉为中心向四周呈放射状，肝细胞规整，胞质染色均匀，细胞核呈圆形或椭圆形，染色均匀，见图5;模型组肝小叶结构紊乱，细胞核出现空泡样变性，部分核破裂及溶解，染色不均匀，见图6;电针组与手针组肝小叶较整齐，细胞核空泡样变、破裂及溶解现象较模型组明显减少，见图7、图8。

2.2.3 肾脏 光镜下，对照组肾小球及肾小管上皮细胞结构正常，细胞质染色均匀，细胞核呈圆形或椭圆形，染色均匀，见图9;模型组肾小管出现萎缩或扩张现象，上皮细胞核有空泡样变，并有碎裂及溶解，出现无核区，染色不均匀，见图10;电针组与手针组肾小管形态较规则，上皮细胞变性程度较模型组明显减轻，见图11、图12。

2.3 各脏器细胞凋亡结果

细胞凋亡结果以凋亡指数(AI)表示，即每100细胞中凋亡细胞的个数。图像分析结果显示，心脏、肝脏和肾脏组织细胞凋亡指数，模型组与对照组比较均有非常显著意义(P＜0.01)，手针组、电针组与模型组比较差异均有非常显著意义(P＜0.01)，电针组与手针组比较差异有显著意义(P＜0.05)，提示吗啡依赖可以促进心脏、肝脏及肾脏组织的细胞凋亡，而电针可以有效的抑制细胞凋亡。见表2。

表2 各脏器细胞凋亡的AI值(%，m±s)

2.4 各脏器细胞Bax、Bcl－2蛋白表达的检测结果

图像分析结果显示，见表3、表4、表5，对于心脏、肝脏和肾脏组织，手针组、电针组、模型组和对照组比较Bax、Bcl－2蛋白均有表达，差异有非常显著意义(P＜0.01)，其中模型组以Bax值升高为主，Bcl－2/Bax较对照组明显减低;手针组和电针组以Bcl－2值升高为主，Bcl－2/Bax较对照组明显升高。手针组、电针组与模型组Bax、Bcl－2蛋白表达比较差异有非常显著意义(P＜0.01)，以Bcl－2值升高为主，Bcl－2/Bax较模型组明显升高。电针组与手针组 Bax、Bcl－2蛋白表达比较差异有显著意义(P＜0.05)，提示吗啡依赖后能明显的促进心脏、肝脏和肾脏组织的Bax蛋白的表达，而针刺能抑制其Bax蛋白的表达，促进其Bcl－2蛋白的表达，其中电针的效果明显。

表3 心脏组织Bcl－2和Bax蛋白表达阳性细胞数(个/mm2，m ±s)

表4 肝脏组织Bcl－2和Bax蛋白表达阳性细胞数(个/mm2，m ±s)

表5 肾脏组织Bcl－2和Bax蛋白表达阳性细胞数(个/mm2，m ±s)

3 讨论

本实验及其他相关研究表明，吗啡经体内代谢过程对脏器有不同程度的损伤，以心脏、肝脏、肾脏为主，其组织结构破坏继而造成其功能障碍进而并发躯体疾病是戒毒过程中致死的不可忽视的原因，罗氏等[6]在阿片类物质依赖者常见并发躯体疾病调查报告显示参与调查的2 583例中有1 768例患有躯体并发疾病，占调查人数的68.45%，共涉及8类33种疾病。患有躯体并发疾病的阿片类滥用者的平均年龄与整体样本无差别，但患有躯体并发疾病者的平均滥用量大，滥用时间长，提示滥用量大和滥用时间长可能是并发躯体疾病多的原因之一。其中以循环系统疾病、消化系统疾病、泌尿生殖系统疾病并发为主。现代医学认为脏器细胞凋亡是促进躯体重要脏器损伤的主要因素，细胞凋亡是由基因介导的一种细胞“主动自杀”的死亡方式。业已证明[7～9]，Bcl－2 和 Bax参与细胞凋亡的精密调控，Bcl－2基因是目前发现的抗凋亡作用最强的基因之一，Bcl－2抗凋亡是通过抗氧化，抑制促凋亡蛋白释放和促凋亡调节子Bax的细胞毒性等机制完成的。Bax为Bcl－2的相关蛋白，可与Bcl－2呈共价结合，它在结构上与Bcl－2有广泛的氨基酸同源性，集中在高度保守区Ⅰ和Ⅱ内。Bax由6个外显子编码。在体内Bax形成同源二聚体或与 Bcl－2形成异源二聚体，Bax－Bax二聚体形成并增加时，便促进细胞凋亡发生，再者Bax的过度表达可加速IL－3依赖细胞株撤除IL－3所致的凋亡，也对抗Bcl－2抑制凋亡的活性。本实验通过检测大鼠重要脏器的细胞凋亡及Bax、Bcl－2蛋白表达，证实吗啡依赖能明显促进其细胞凋亡，使其Bax蛋白表达明显增高，通过针刺方法，尤其是电针能有效的抑制大鼠心、肝、肾重要脏器的细胞凋亡，使Bax蛋白表达明显降低，Bcl－2蛋白表达明显增高，从而对其损伤后的组织结构起到修复作用，减轻因损伤引发的功能障碍，降低吗啡戒断过程中躯体并发症的发生及致死率。

祖国医学认为毒品如吗啡产生依赖性是因毒液及烟毒蕴结于内，使气血津液受损，终致脏腑阴阳失调，主要涉及的脏腑为心肝肾三脏，清代医家对鸦片成瘾有肺瘾、心瘾、脾瘾、肝瘾、肾瘾等五脏瘾证[10]之说，谢氏[11]在对戒断综合征的中医辨证分型中包括心瘾气虚证、心瘾阳虚证、心瘾阴阳两虚证、心瘾阳气暴脱证;肝瘾血虚证;肾瘾阳虚证、肾瘾阴阳两虚证。综合以上病因病机，治疗中选取百会(醒脑开窍、安神定志)、双侧心俞(补益心气、养心安神)、肝俞(疏肝养血、平肝潜阳)、肾俞(温补肾阳、滋补肾阴)、足三里(调理脾胃、补中益气)、三阴交(健脾益血、调肝补肾)，加以电针刺激使气血周动，濡养周身，致五脏六腑阴阳调和，功能恢复。本实验的结果说明电针刺激以上诸穴位能明显的抑制吗啡依赖大鼠的戒断症状，减轻其躯体并发症。综上所述，笔者认为吗啡依赖后会导致全身脏器尤其是心脏、肝脏、肾脏重要脏器的组织结构损伤和功能紊乱，本实验证实与其组织细胞凋亡关系确切，因而在戒断综合征的治疗过程中应对戒毒者相关的躯体并发疾病予以重视并进行相应的对症治疗。本实验说明电针刺激百会、双侧心俞、肝俞、肾俞、足三里、三阴交穴能有效的抑制吗啡依赖大鼠重要脏器组织的细胞凋亡，对损伤后脏器的组织结构具有明显可塑作用，通过调控细胞凋亡来治疗戒断过程中产生的躯体并发疾病是其可能机制。

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