LC－MS／MS测定猪尿中的黄曲霉毒素M1

吕 飞，钟伟龙，朱事康，吴云普，周 宇，曹维强，余优军

（惠州出入境检验检疫局综合技术中心，广东 惠州516006）

黄曲霉毒素 M1（AFTM1）是黄曲霉毒素B1的4－羟基衍生物，是AFTB1在体内经过羟化而衍生成的代谢产物［1－2］，一部分从尿和乳汁排出，另一部分存在于动物的可食部分中。主要存在于土壤、动植物、霉变谷物、各种坚果、食品、调味品、食用油、牛奶和奶制品等霉变制品中［3］，直接或间接进入人类食物链，是致癌致畸致突变的毒物，严重威胁人类健康和生命安全。目前，测定的方法主要有薄层色谱法、高效液相色谱法、酶联免疫吸附测定法、质谱法和放射免疫测定法。常见的检测基质有粮油、奶制品、动物性食品、饲料、真菌和花生制品。但对猪尿的直接检测还未见有相关的检测方法。本文选择尿液作为检测基质主要是考虑取样简便和成本低廉。

目前世界各国对黄曲霉毒素M1的限量标准意见不统一。欧盟提出乳中黄曲霉毒素M1的限量为0.05μg／kg；美国、日本等国提出的限量为 0.5 μg／kg［4］。我国也只是在相关婴幼儿的产品中做了一些限量标准（见表1），对包括猪尿样在内的其他样品均未涉及限量标准。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 猪尿（实验室检测样品）；黄曲霉毒素 M1标准品（纯度＞95.0%，CNS：6795－23－9）；甲醇、乙腈、甲酸（均为色谱纯）德国Meker公司；水为GB／T 6682规定的一级水。

1.2 仪器与设备 AB 3200QTRap液相色谱串联质谱仪，配Agilent1200型液相色谱仪 恒信业（香港）有限公司；MS2振荡器、Waters固相萃取装置广州市华粤行仪器有限公司；免疫亲和层析柱Agela Technologies；0.22μm有机相滤膜 广州振祥有限公司。

表1 我国规定食品中黄曲霉毒素M1最大限量值 （μg／kg）

1.3 方法

1.3.1 标准曲线的绘制 准确称取黄曲霉毒素M1标准品，用甲醇稀释并定容至10mL棕色容量瓶中，摇匀，制备成质量浓度为10.0mg／L的标准储备液，置于－20℃冰箱保存。准确吸取标准储备液，用甲醇制备成质量浓度为0.01、0.05、0.08、0.10、0.50μg／L的标准使用液，标准使用液使用前配制。以组分的峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标，绘制标准曲线。外标法定量。

1.3.2 分离条件［5］（1）液相色谱分离条件：色谱柱为 Aglient XDB－C18（50mm×4.6mm，1.8 μm）；流速为0.3mL／min；进样量为10μL；柱温为35℃。流动相为A：0.1%甲酸水溶液，B：乙腈＋甲醇（1＋1）；梯度洗脱（见表2）。（2）质谱参考条件及检测方式：多离子反应监测（MRM），详见表3中母离子、子离子和碰撞能量。

表2 液相色谱梯度洗脱条件

表3 离子选择参数表

1.3.3 样品处理 （1）提取：准确量取5.0mL（精确到0.01mL）猪尿样置于50mL离心管中，用超纯水定容到50mL，旋涡混合1min，待净化。（2）净化：将一次性的50mL注射器筒与亲和柱串联，再将亲和柱与固相萃取装置连接起来。将待净化液倒入50mL的注射器筒内，去掉亲和柱下方堵头，调节开关，使液体以每秒1滴的速度流出，待液体排干后，更换新的50mL的注射器筒，用10mL水溶液洗涤1次，流速为每秒2滴，待液体排干后，更换新的注射器筒，用1mL甲醇洗脱，流速为每秒1滴，洗脱液过0.22μm 滤膜后上LC－MS／MS检测。（3）样品测定：取供上机检测的样品溶液10μL注入仪器中。根据样液中黄曲霉毒素M1含量的情况，选取相应值相近的标准工作溶液，标准工作溶液和待测样液中黄曲霉毒素M1含量的相应值均应在仪器的线性范围内，对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定。与标准的保留时间比较定性，外标法定量。在1.3.2节分离条件下，黄曲霉毒素 M1的参考保留时间为2.32min左右。

2 结果与分析［6－11］

2.1 样品的预处理

2.1.1 提取溶剂的选择 因为奶粉中黄曲霉毒素M1用超纯水溶解进行检测，也考虑用水对猪尿进行稀释过免疫亲和柱，进行添加回收率的试验结果较好，所以采用水作为提取溶剂。

2.1.2 洗脱液的选择 因为黄曲霉毒素M1易溶于油、甲醇、丙酮和氯仿等有机溶剂中，而且标准溶液的配制选用了甲醇，所以用甲醇作为洗脱液，试验结果也同时表明可以用甲醇做洗脱液。

2.2 标准色谱图和样品加标色谱图 按照以上的测定方法得到黄曲霉毒素M1的标准色谱图，样品空白色谱图和样品加标（0.10μg／L）色谱图（图1～3）。

2.3 方法的线性关系 黄曲霉毒素 M1在0.01 μg／L～0.50μg／L内线性关系显著，相关系数为0.999。

2.4 最低检测限 黄曲霉毒素M1的最低检测限为0.01μg／kg。

2.5 方法的加标回收率 由表4可见，在添加浓度在0.01～0.10μg／kg范围内，回收率在74.5%～94.0%之间，RSD在2.32%～3.90%之间，样品的回收效果较好。

表4 样品加标平均回收率 （n＝6）

3 结语

本试验旨在建立猪尿中黄曲霉毒素M1的LC－MS／MS检测方法。实现猪尿中黄曲霉毒素M1的快速检测。此法操作简便、快速、灵敏、准确，样品处理简便易行，适用于测定猪尿中黄曲霉毒素 M1。

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