冻融法提取脾脏转移因子影响因素的试验

刘 尧，刘宗柱

（青岛农业大学生命科学学院，山东 青岛 266109）

转移因子（Transfer factor，TF）是免疫活性淋巴细胞所释放的参与机体免疫功能的多肽与寡聚核苷酸的混合物，可以将供体的免疫特性转移给受体的淋巴细胞，从而提高机体免疫功能。兽医临床常用以提高机体免疫机能以及解除免疫抑制［1-2］。TF提高机体免疫力的作用无种属特异性，可以在不同种属的动物之间相互转移免疫信息。随着我国畜禽养殖中免疫抑制性疾病的多发，TF相关制剂的应用愈发具有重要的临床意义。目前，制备TF的原料较多应用的是猪、肉鸡等动物的脾脏，制备工艺多采用反复冻融、高压均质、离心、透析或超滤等工艺，但目前对转移因子提取效率的影响因素方面的研究很少报道。本试验以猪脾脏为试验原料，主要研究了冻融次数、透析时间及匀浆介质对猪脾脏转移因子中多肽及核酸含量的影响，以期为猪脾脏TF制备工艺的优化提供借鉴。

1 材料与方法

商品猪新鲜脾脏（购自金锣食品集团公司屠宰场）；UV-2401PC型紫外分光光度计（日本岛津）；透析袋（21mm，USA进口）；绞肉机；组织匀浆机。

1.1 试验材料及预处理 猪脾脏购自山东金锣食品集团公司屠宰场，-20℃保存备用。试验时将猪脾脏去筋膜、脂肪，剪碎，等分为不同匀浆介质的两组，其中一组按组织湿重1∶1的比例加入生理盐水，另一组按组织湿重1∶1的比例加入去离子水，分别置绞肉机中搅碎，转移到组织捣碎机中匀浆，备用。

不同匀浆介质处理后的脾脏匀浆分别装于数支5mL聚乙烯离心管中，分别设置冻融4、6、8、10、12次；冻融结束后置于离心机中于4000r／min离心20min，取上清液4mL转入透析袋中，置于2倍体积的缓冲液中分别透析0.5、1、2、4、8、12、24、36、48h。透析结束后取透析液于4℃保存待测。

1.2 透析液中转移因子多肽与核酸浓度测定 透析液中多肽含量用Lowery（福林酚）法测定；核酸用苔黑酚法测定；每个取样点设置3个平行样，各点的数值为平行样的平均值。

1.3 数据处理 透析不同时间点多肽及核酸的浓度数值以平均值 标准差表示，SPSS软件检验其差异的显著性。

2 结果

2.1 匀浆介质及冻融次数对转移因子提取效率的影响 通过预备试验，初步确定了透析时间为24h时透析液中多肽及核酸基本达到透析平衡。对不同匀浆介质和冻融次数处理后，测定上清液透析24h时透析液中多肽浓度、核酸浓度的变化如图1、2所示。

反复冻融6次时，透析液中多肽的浓度最高，冻融次数超过8次，透析液中多肽浓度反而有降低的趋势。原因可能在于冻融次数过多使细胞内溶酶体水解酶释放较多，从而使多肽等活性成分降解的比例增加。不同冻融次数下以去离子水为匀浆介质的多肽收率均略高于生理盐水，说明以去离子水为匀浆介质破碎细胞的效果较好。

透析液中核酸的变化趋势与多肽浓度的变化基本一致（图2）。以去离子水为匀浆介质，反复冻融4、6、8、10次和12次时，透析出的核酸浓度比生理盐水更高，说明去离子水为匀浆介质在反复冻融过程中对细胞膜的破坏更有助于核酸的释放。

2.2 透析时间对转移因子提取率的影响 通过对冻融次数和匀浆液的试验为基础，我们选定用去离子水匀浆，匀浆液冻融6次，对多肽以及核酸透析达到平衡的时间进行研究。结果如图3所示。

从图3可以看出，随着透析时间的增加，转移因子中多肽的含量不断增加，在透析24h的时候基本趋向平稳，虽然在48h的时候达到了高峰，但与透析24h相比，其升高的幅度并不大，因而从生产效率的角度考虑，对于多肽的收率，透析24h就已足够。

在12h前，核酸的含量随着透析时间的增加稳步快速上升，12h以后上升的速度开始下降，直到24h时达到峰值，此后核酸的含量开始下降。

3 讨论

转移因子因其独特的作用特点在兽医临床的应用越来越广泛，但对于转移因子制备技术方面的研究报道尚不多见。邓夕军等研究了在匀浆液中加入柠檬酸钠作为凝絮剂，可以加快反复冻融后离心分离上清液的速度，并比较了超滤法和透析法的分离效率，但对于反复冻融次数、匀浆介质以及透析的合适时间等因素没有涉及［3］。

利用猪脾脏提取转移因子的关键步骤是破碎细胞，使细胞内的多肽及核酸充分释放出来。反复冻融法破碎细胞的基本原理在于，当组织匀浆处于冰点时，细胞内外的水分形成冰晶结构，冰晶体积的膨胀导致细胞的膜结构被破坏。伴随着这一过程，细胞局部的脱水、pH值的变化等，也会导致细胞膜结构的变化。不同的匀浆介质会影响冰晶形成的过程以及细胞内外的渗透压梯度的大小，从而影响冻融时细胞的破碎效果。目前所报道的转移因子制备方法中，匀浆介质有的采用去离子水，有的采用生理盐水，但采用不同的匀浆介质对转移因子提取效率的影响未见报道。本试验结果表明，用去离子水的效果要明显好于用生理盐水，这是因为用去离子水时脾脏细胞的内外渗透压要大于用生理盐水时的渗透压，更容易使细胞破碎，让细胞内容物更容易释放出来。

反复冻融结合高压均质或超声破碎细胞，仍是目前转移因子规模化生产的常规方法。生产过程中的反复冷冻是一个相对耗能、耗时的环节，也是影响转移因子生产成本的重要因素。目前报道的方法中反复冻融的次数在3～10次不等［4-5］，我们的试验结果表明，反复冻融6次以上，多肽及核酸的透析浓度并没有显著增加。说明脾脏细胞经过6次反复冻融已基本破碎完全，根据生产实际选择冻融次数4～6次是比较合适的，太多的反复冻融没有什么意义，反而增加生产成本。

多肽的透析到24h的时候趋向稳定，虽然此后还缓慢增长，但是增长并不显著，而核酸在12h以前含量急速上升，在12h到24h比较平稳且缓慢地上升，这是由透析的原理决定的，即当透析内外液浓度达到动态平衡时透析就宣告结束，继续透析已无实际价值。提高透析效率的简单有效措施是多次透析，因此在条件允许的情况下，实施多段分次透析，透析外液使用去离子水，提高浓度差，从而提高转移因子的收率。另外，采用中空纤维超滤法制备转移因子，具有提取效率高、生产功效高的特点［4］，是值得推广的规模化生产方法。

［1］李犹平，房春林，陈元坤，等.转移因子对猪瘟和猪蓝耳病疫苗免疫增强效果试验［J］.兽医导刊，2010，2：47-48.

［2］李鑫.转移因子的研究进展［J］.畜禽业，2010，6（254）：38-40.

［3］邓夕军，黄显泰，李俊山，等.猪脾转移因子口服液的工艺改进［J］.中国现代应用医学，1998，15（3）：58-59.

［4］闫肃，杨琳，申镇维，等.转移因子口服液制备方法的研究［J］.中国卫生工程学，2007，6（6）：355-356.

［5］张 英，刘松财.犬特异性转移因子的制备及其免疫活性检测［J］.动物医学进展，2010，31（S）：162-165.