大鲵细菌性感染综合症的病原分离与药敏试验分析

于 喆，江 辉，钟 蕾，肖克宇，谭 情，毛 盼

(湖南农业大学动物科学技术学院, 中国 长沙 410128)

大鲵(Andriasdavideanus),也称娃娃鱼,是我国特有的珍稀有尾两栖动物, 国家二级保护动物,其经济价值高,具有广泛开发利用的前景[1]．为恢复和有效利用大鲵资源，自20世纪60年代起国内有许多单位开始对大鲵进行人工养殖研究，并取得了较好的效果．但近年来随着养殖规模不断扩大，养殖大鲵经常发生各种疾病,给广大养殖户造成惨重的经济损失．2010年10月份,贵州松桃龙洞原生态科技发展有限公司大鲵养殖场发生了细菌性感染综合症，该病国内虽有报道[2]，并分离鉴定病原菌为嗜水气单胞菌，但病原种类和症状等多样的原因尚有争议.发病症状主要表现为患病大鲵头部红肿溃烂，腹部肿胀积有大量腹水，肝脏肿大，体表黏液部分脱落,体表和四肢有绿豆大小的白斑，随着病情的发展,白色斑点进一步腐烂成溃疡状直至暴露红色的肌肉．患病大鲵四肢无力，食欲减退直至死亡．养殖者在铒料中添加庆大霉素(Gentamicin)进行试治，效果不显著．笔者就此进行相关研究，分离到3种致病菌，现报道如下．

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 材料 患病大鲵来自贵州松桃龙洞原生态科技发展有限公司大鲵养殖场，体重70～100 g；牛蛙来自长沙市马王堆水产市场，健康正常，体重100～150 g，在水族箱内驯养一周．

1.1.2 培养基 营养琼脂培养基：牛肉膏 3.0 g，蛋白胨 10.0 g，NaCl 5.0 g，琼脂 15.0 g，加水补充到1 000 mL，pH 7.0．

1.2 方法

1.2.1 病原菌分离 从贵州松桃龙洞原生态科技发展有限公司大鲵养殖场采集体长14～22 cm,体重70～100 g的濒死大鲵4尾，解剖，用接种环在体表、肝脏、肾脏、肠道、四肢、腹水等病灶部位挑取少量组织液，分别在普通营养琼脂平板上划线接种, 于28 ℃恒温培养24 h, 选取单个菌落接种于斜面, 再进行平板划线, 将分离到的细菌提纯培养，保存至斜面备用．

1.2.2 分离菌的菌落形态观察及染色 对培养出的细菌菌落进行观察,并对其大小、形态、颜色、隆起度等特征进行记录．对分离纯化的上述培养菌进行革兰氏染色,观察细菌的个体形态及染色特征．

1.2.3 分离菌的生理生化特性检查及菌种鉴定 取分离纯化的上述培养菌, 分别进行氧化酶、葡萄糖发酵等试验,鉴定其生物学特征，同时进行接触酶、七叶苷、吲哚、糖( 醇及苷)类代谢等较系统的理化特性测定,具体方法参照《常见细菌系统鉴定手册》[3]和《伯杰细菌鉴定手册》[4]．

1.2.4 人工感染牛蛙试验 将分离菌18 h培养物制成菌悬液，菌浓度稀释为2.0×109/mL, 然后分别对100 g左右健康的牛蛙进行腹腔注射感染,每尾注射剂量为0.5 mL．以注射等量无菌生理盐水的健康牛蛙作为对照,根据菌种数量分为若干组， 另设多株菌混合感染组，其中每菌种菌液用量相等．各组注射试验牛蛙各10尾．连续14 d观察并记录试验牛蛙的病症及死亡数目, 计算其死亡率．同时对人工感染发病濒死的牛蛙进行病原菌再分离, 检查所分离的菌株与原分离菌株在形态与理化特性等方面是否一致．

1.2.5 药物敏感试验 按常规药敏纸片法测定抗生素对分离菌株的抗菌谱, 以涂布法接种分离菌株, 然后将药敏纸片贴在培养基上, 28 ℃培养18～24 h 后, 测定抑菌圈直径,参照NCCLS判断标准[5]进行敏感性判定．检测的抗生素包括呋喃妥因、阿米卡星、氨苄西林/舒巴坦、氨曲南、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢他啶、氯霉素、环丙沙星、庆大霉素、左氟沙星、美洛培南、美洛西林、哌拉西林/他唑巴坦、妥布霉素、复方新诺明、头孢曲松、头孢吡肟、氨苄西林、强力霉素、磷霉素等21种，药敏纸片购自杭州天和微生物试剂有限公司．

2 结果

2.1 菌株分离结果

从患病大鲵的体表、肝脏、肾脏、肠道、四肢、腹水中共分离到12株细菌，分别编号为XCS10-1、XCS10-2、XCS10-3、XCS10-4、XCS10-5、XCS10-6、XCS10-7、XCS10-8、XCS10-9、XCS10-10、XCS10-11、XCS10-12．

2.2 分离菌的菌落形态及染色结果

经过观察和筛选，根据菌落特征，并通过革兰氏染色初步鉴定分离的12株菌共分为3组细菌，从中再各选一株代表性菌株进行系统鉴定，分别标记为Y2010-1、Y2010-2、Y2010-3．

其中Y2010-1 的菌落直径为2 mm 左右，乳白色、圆形、隆起、光滑．革兰氏阴性杆菌，氧化酶阳性，葡萄糖发酵试验阳性；Y2010-2的菌落直径为1.5 mm左右，白色半透明、圆形、隆起、光滑．革兰氏阴性杆菌，氧化酶阴性，葡萄糖发酵试验阴性；Y2010-3 的菌落直径为2 mm左右，白色透明、圆形、隆起、粗糙．革兰氏阴性杆菌，氧化酶阴性，葡萄糖发酵试验阳性．3个株菌的形态见图1．

图1 Y2010-1、Y2010-2、Y2010-3株菌(从左至右)的形态(Gram染色，100× )

2.3 分离菌的生理生化特性及菌种鉴定结果

根据细菌的形态特征及生理生化鉴定结果，参照《常见细菌系统鉴定手册》[3]和《伯杰细菌鉴定手册》[4]，确定分离的3组纯病原菌Y2010-1、Y2010-2、Y2010-3 分别为布拉克枸橼酸杆菌(Citrobacterbraakii)、嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)和洛菲不动杆菌(Acinetobacterlwoffi) (见表1)．

表1 分离菌株生理生化反应

注：+代表阳性；-代表阴性

2.4 分离菌的人工感染试验

将分离出的菌株Y2010-1、Y2010-2、Y2010-3分别和混合注射感染健康牛蛙, 感染后第三天各组均有牛蛙死亡，直至第六天Y2010-1和混合感染组仍有蛙死亡，但第七天至第十四天, 均未再出现死亡．其中混合组感染牛蛙死亡率高达100%，Y2010-2死亡率为80%，Y2010-1死亡率为50%,Y2010-3死亡率为40%，而对照组牛蛙均未发现病变及死亡(见表2).

表2 健康牛蛙人工感染结果

观察病死蛙部分有大鲵自然发病相似病变，大鲵体表病变见图2所示．3种菌分别感染致死的牛蛙均有体表出血或充血肿胀症状，但3种菌混合感染的病蛙还有皮肤局部溃烂，眼球外突等大鲵自然发病相似病状(见图3)，腹部积有多量腹水，肝脏呈现肿大等病症．从人工感染濒死的牛蛙体内又分离到与原分离菌株形态特征及生理生化特性一致的细菌．

A B图2 自然发病大鲵的体表病变

图3 人工感染后牛蛙的体表病变

2.5 药敏试验结果

3个被测致病菌株对21种抗菌药物的敏感性见表3．

表3 分离菌株的药物敏感性试验结果

注：R表示耐药，S表示敏感，I表示中介.

表3表明，3种致病菌对供试抗菌药均存在不同程度的耐药性，仅对美洛培南敏感，对大鲵铒料中添加的庆大霉素都不敏感．

3 讨论

在人工养殖过程中，我国已经确认大鲵发生细菌性疾病的病原先后有荧光假单胞菌、迟钝爱德华菌、恶臭假单胞菌、杀鲑气单胞菌杀鲑亚种、维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌、柱状黄杆菌、温和气单胞菌等[6-15]．本研究从大鲵细菌性感染综合症病鲵体内除分离到嗜水气单胞菌外，还分离到布拉克枸橼酸杆菌、洛菲不动杆菌，虽然孟彦等[11]也从大鲵腹水病体分离到洛菲氏不动杆菌、费氏枸橼酸杆菌以及蜡样芽孢杆菌3种菌，但认为只有嗜水气单胞菌对大鲵有致病性，而否定了这3种菌是大鲵的病原菌.作者用牛蛙作致病性实验的结果表明，从大鲵分离的嗜水气单胞菌、布拉克枸橼酸杆菌、洛菲不动杆菌对牛蛙的死亡率分别为80%、50%和40%，尽管发病动物呈现急性死亡表现，皮肤溃烂不明显，死亡率都未达100%，嗜水单胞菌的致病性也比前人研究的有所降低，但各攻毒组均有牛蛙死亡，尤其是3种菌混合感染的致病性明显增强，出现全部死亡，肿胀、溃烂等疾病症状更为典型.这一结果一方面说明牛蛙与大鲵均属两栖类，其生物学特性与对病原菌的敏感性存在差异但极为相近， 另外说明3种菌混合感染确实会增加相互的致病性，大鲵自然发病时表现多种症状和病变与多种细菌感染有关，这3种菌都是大鲵细菌性感染综合症的病原菌，本试验为该病的多病原综合感染的发生及机制提供了一定的理论与实验依据．

在人和珍稀动物病原菌的致病力实验中，往往采用小动物替代本动物作为实验动物.大鲵是国家二类保护动物，目前价格昂贵，资源有限，实验中很难用于大鲵病原的人工感染实验，选用并建立其适宜的实验动物模型有一定理论意义和应用价值，王印、钟蕾、王 旭和余波[10，12，14-15]等分别用斑点叉尾鮰、鲫鱼、小鼠、鳖进行过大鲵病原菌的人工感染试验，虽然有不错的结果，但无论从本试验结果和动物差异性上分析，同为两栖类，牛蛙代替用于大鲵其致病性试验的低成本、可靠性、准确性和可行性均是值得首推的，不过这仍有待进一步验证．

布拉克枸橼酸杆菌(Citrobacterbraakii)又称布拉克柠檬酸杆菌,常寄生于人和动物肠道，广泛分布于自然界及医院环境中，属条件致病菌．据报道，本菌虽仍不是临床十分常见菌株，但发生感染的频率较过往有所增加，且感染的部位广泛，以呼吸道为主，其次为伤口和脓肿[16-17]. 刘红梅等[18]研究表明，枸橼酸杆菌对常用的抗菌药物呈现出不同程度的耐药现象, 172株枸橼酸杆菌对氨苄西林、头孢唑啉、头孢西丁的耐药率较高, 达87%以上, 对阿米卡星、亚胺培南、舒普深的耐药率较低, 均小于20%．高正勇等[19]从大鲵细菌性感染病分离出的致病菌为弗氏枸橼酸杆菌，药敏试验表明其对氨曲南、头孢三嗪、先锋噻肟、先锋必等9 种药物敏感;对氧哌嗪青霉素、左氟沙星、米诺环素、壮观霉素、卡那霉素、对氟沙星、氟哌酸、头孢西丁、环丙沙星、妥布霉素中度敏感; 对四环素、克林霉素、红霉素、克拉霉素、氯霉素等16 种药物不敏感．

嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)是一类广泛存在于水环境的常见菌, 它能引发多种水生动物的传染病.有关嗜水气单胞菌致病性的研究，已有过大量的报道[20]．郭闯等[21]从患病甲鱼、河蟹、牛蛙、鲫体内共分离到14 株气单胞菌属细菌，经鉴定，其中8株为嗜水气单胞菌．其对羧苄青霉素、青霉素G、氨苄青霉素、苯唑新霉素等药物均为耐药,而对喹诺酮类、链霉素、庆大霉素、氟苯尼考等药物高度敏感．汪开毓等[2]从大鲵细菌性感染病中分离出的致病菌为嗜水气单胞菌．药敏试验表明, 嗜水气单胞菌对氟苯尼考、链霉素、环丙沙星、氟洁霉素和丁胺卡那霉素最敏感, 对新霉素次之, 而对四环素、强力霉素、青霉素、头孢菌素、磺胺异嚼唑、氟哌酸不敏感．

洛菲不动杆菌(Acinetobacterlwoffi)广泛分布于水、土壤、人体皮肤、口腔黏膜呼吸道和泌尿道等部位，具有不动杆菌的耐药特性,是一种条件致病菌, 随着广谱抗生素的大量应用，其感染及耐药性日趋严重，其临床多重耐药性也屡见报道[22]．但在水产养殖上，对该菌报道不多见．濮本恒等[23]对洛菲不动杆菌的耐药性检测结果显示,该菌对妥布霉素、氧哌嗪青霉素/他唑巴坦、庆大霉素、头孢西丁、加替沙星、左氧沙星、环丙沙星耐药率在30%左右，氨曲南、氨苄青霉素/青霉烷砜、头孢噻肟、复方新诺明、头孢唑啉、氨苄青霉素的耐药率均大于60%．

本研究中所进行的药敏试验表明，3种病原菌对哌拉西林/他唑巴坦和美洛培南敏感，对庆大霉素都不敏感，且存在不同程度的耐药性．这也解释了养殖过程中添加庆大霉素效果不明显的原因，且病原菌对大部分的广谱抗生素都产生一定耐药性，这和前人相关研究结果不尽相同,这可能是由于不同地方、不同养殖环境中养殖大鲵病原菌因接触不同的药物环境影响而产生的耐药性变异．随着抗生素类药物的滥用以及许多新的诊疗方法的使用, 使得病原微生物的种类和耐药性发生了改变, 许多条件致病菌已成为主要的致病菌, 原来对临床常用抗菌药物敏感的致病菌和条件致病菌, 逐步变成多重耐药菌甚至是泛耐药菌, 而细菌的耐药性常常是不可逆的, 这无疑给治疗大鲵细菌性疾病带来了难度．如今, 细菌的耐药性已成为全球性问题．合理使用抗生素类药物, 对防治日益严重的感染、减少耐药菌的产生以及控制耐药菌的传播均具有十分重要的意义．

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