高盐负荷上调SHR胸主动脉、肠系膜上动脉壁AT1和AT2受体表达实验研究＊

西安交通大学医学院第一附属医院心血管内科（西安710061）

吕 颖 孙超峰△ 殷艳蓉 张军波 潘军强 韩稳琦 周 鑫 杨 琳＃

盐是高血压的一个重要环境因素，高盐摄入大动脉弹性的增龄性改变以及对血管局部肾素-血管紧张素系统 RAS的影响［1］。

血液循环中的肾素-血管紧张素系统RAS通过对血容量及外周阻力的控制，调节机体的血压及水、电解质平衡，而局部RAS参与细胞生长发育，在血压维持及高血压病的发生发展中起着极其重要的作用。血管局部RAS中最主要的效应物AngⅡ（血管紧张素Ⅱ）质参与大动脉僵硬化的形成［2］。AngⅡ与AT1（血管紧张素Ⅱ的1型受体）结合后，除强有力的血管收缩作用、促醛固酮分泌之外，能刺激细胞因子如TGF-B（转化生长因子-B）、骨桥蛋白等的产生，促进细胞增殖和肥大，促进细胞外基质积聚，还有促纤维化和促炎症反应的作用。AT2（血管紧张素II的2型受体）可能在病理状态下的心血管系统中存在过表达，对抗AngⅡ通过AT1介导的生物效应，参与血管舒张、抑制增殖、促进凋亡及组织分化［3］，现报告如下。

材料与方法

1 材 料 51周龄组雄性SHR共60只（第四军医大学动物实验中心提供），0.4%NaCl及4%NaCl饲料由西安交大医学院动物中心配置。试剂来源：一抗①Anti-Human AT2cat＃AT21-A，Aff.Pure Bat.＃3369A4 100ug低压冻干粉adi4生物制剂公司，②Anti-RAT AT1cat＃AT11-A，Aff.Pure Bat.＃332930A2L100ug／100ul溶液adi4生物制剂公司；二抗试剂盒：SA1022即用型SABC免疫纯化试剂盒兔IgG1／2KIT（武汉博士德生物工程有限公司）；DAB显色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。其余试剂均为国产分析纯。鼠尾测压仪为RBP-I型大鼠血压心率测定仪（中日友好医院临床研究所制造）。

2 方 法

2.1 测血压：所有动物自由饮水，环境12∶12h光暗循环，温度：18～25℃，湿度：45%～65%，氨浓度：＜20mg／L，换气量：1.27m／h。两组SHR大鼠预适应1w后应用鼠尾血压计检测尾动脉收缩压（SBP），测量3次，取平均值。干预后，再次检测SBP。

2.2 标本固定、取材、包埋及染色：SHR大鼠末次测血压后第二天，称重后苯巴比妥钠（50mg／kg）麻醉，4%多聚甲醛灌注取材，后固定24h，石蜡包埋，5 μm切片后Mallory染色，免疫组化SABC法（一抗浓度1∶50）测定ATR表达谱的改变，以每个视野的阳性物质的灰度值（gray density）表示蛋白表达水平。

2.3 图像采集及统计分析：采用德国Leica公司QWin550CW图像系统进行采集与分析。Mallory三色染色：蓝色胶原纤维（Ⅰ型和Ⅲ型）的累积光密度值（IOD），显示纤维化程度。免疫组化SABC法染色：高倍镜下，选3个血管视野，测定每个视野的阳性物质的灰度值（gray density）。数据以均数±标准差（±s）表示，采用SPSS10.0软件进行统计分析。计量对正态分布且方差齐同资料采用单因素方差分析检验，各组之间两两比较用LSD-U法。P﹤0.05具有统计学意义。

结 果

1 高盐或低盐干预前后两组SHR收缩压比较

高盐或低盐干预前高盐及低盐组收缩压比较无显著性差异（P＞0.05），干预后，高盐组收缩压高于低盐组（P＜0.05），见表1。

表1 干预前后高盐及低盐组SHR收缩压的比较（±s）

表1 干预前后高盐及低盐组SHR收缩压的比较（±s）

注：干预后高盐组较低盐组＊P＜0.05。

组 别 n 干预前SBP（mmHg）干预后SBP（mmHg）30 167±16.5161.3±10.8高盐组 30 164±15.7190±19.3低盐组＊

2 盐负荷对血管壁胶原纤维的影响 高盐或低盐干预后，胸主动脉及肠系膜上动脉高盐组IOD均高于低盐组（P＜0.01），见表2、图1。

表2 SHR低盐组和高盐组动脉Mallory染色IOD值的比较

图1 盐干预对肠系膜上动脉血管壁纤维化的影响（Mallory染色 ×100）

3 盐负荷对血管壁ATR表达谱的影响 高盐或低盐干预后，胸主动脉高盐组AT1、AT2蛋白表达均高于低盐组（P＜0.01），AT1／AT2比值增大（P＜0.05）；肠系膜上动脉高盐组较低盐组AT1蛋白表达增加（P＜0.01），AT2蛋白表达增加（P＜0.05），AT1／AT2比值无明显变化（P ＞0.05）；见表3、图2。

表3 盐负荷对血管壁ATR表达谱的影响（±s）

表3 盐负荷对血管壁ATR表达谱的影响（±s）

注：表示两亚组间比较＊P＜0.05；表示两亚组间比较，＊＊P＜0.01。

组别AT2低盐组 28 151±12 193±8.2 0.83±0.06 28 151±11 189±12 0胸主动脉n AT1 AT2 AT1／AT2肠系膜上动脉n AT1 AT2 AT1／0.79±0.12.79±0.06高盐组 27 115±11＊＊ 180±12＊＊ 0.80±0.08＊ 27 135±22＊＊ 170±12＊

灰度值（gray degree）与图象颜色深度呈反相关，即灰度值越大，图象颜色深度越浅，表示蛋白的表达越少。

图2 盐负荷对肠系膜上动脉血管壁AT1表达的影响（×100）

讨 论

本研究中，高盐负荷后SHR的收缩压升高，此结果与以往的流行病学研究高盐饮食导致人群血压升高的结果一致［4］。Mallory染色显示胸主动脉及肠系膜上动脉的高盐组血管壁纤维化较低盐组均明显增加，与Hu等［5］低盐负荷后脉搏波测定动脉僵硬度降低，均提示高盐负荷与SHR的血管壁重塑相关。

盐是独立于血压、年龄、肾脏变化的导致血管重塑的危险因素。长期以来，盐介导的血压升高归因于短期的血容量增加和长期的小动脉功能及结构的变化所致的血管阻力增加，本研究同期实验也证实盐负荷后SHR血浆中血浆C型利钠肽（CNP）降低内皮素-1（ET-1）升高［6］。然而，盐介导的心血管系统的改变不仅仅局限于小动脉，也可能存在于大的中心传导动脉及肌性中动脉。本实验中，胸主动脉及肠系膜上动脉分别属于中心性动脉及肌性中动脉，高盐负荷导致在循环RAS受抑制情况下，局部ATR表达上调可能是这两类动脉重塑的机制之一。Tobain［7］首次证实高盐导致SHR动脉重塑，管壁的增厚与胶原纤维的沉积及内分泌网络系统功能异常有关。以上结果支持本实验中，盐与大、中动脉重塑相关，可能与血管局部内分泌系统激活有关。

Georg等［8］采用放免、Northern blotting和 PCR法分别从受体蛋白和mRNA水平证实了高盐对SD大鼠主动脉AT1表达起上调作用，同时用体外高盐孵育血管平滑肌细胞（VSMC）的结果与上述在体实验一致，提示高盐负荷可能通过直接上调AT1参与了高血压的形成。除AngⅡ外，高盐负荷激活的血管局部醛固酮及机械应力均可作用于AT1，醛固酮使肠系膜动脉或VSMC的AT1二聚体蛋白水平升高，引起细胞内谷氨酰胺酶浓度上升，引起血管收缩［9］。

病理状态下，AT2增多，高盐时AT2的增高可能继发于AT1的增高，发挥一定的代偿作用。有研究发现，血压和局部AngⅡ增加将持续上调AT2的表达。而高盐负荷下，SBP及组织AngⅡ表达均升高，也可能是AT2的表达持续上调的机制之一。胸主动脉及肠系膜上动脉的AT1和AT2在高盐负荷时表达均上调，导致两者比值无明显变化，AT2持续发挥拮抗AT1的效应。

本实验中高盐负荷下，AT1蛋白在胸主动脉及肠系膜上动脉表达较低盐负荷明显增高，说明了局部RAS系统在老年收缩期高血压时大、中动脉重塑形成和发展过程中可能起了重要作用。AT2在胸主动脉及肠系膜上动脉高盐亚组表达亦显著高于低盐亚组。在肠系膜上动脉，盐负荷对AT1和AT2表达的影响较胸主动脉更为显著，可能与肠系膜上动脉属于肌性动脉，而胸主动脉属于弹性动脉，肠系膜上动脉VSMC含量多于胸主动脉，而AT1和AT2表达于VSMC和内皮细胞（EC）有关。与Corriu等发现由正常血管壁中收缩型VsMC转变为损伤血管中AT1表达增高的增殖型VSMC一致。

SHR大鼠随着高盐喂养血压升高，胸主动脉及肠系膜上动脉胶原纤维沉积明显增加；AT1及AT2表达均增加，特别是肠系膜上动脉壁；而对AT1／AT2比值未见明显影响。这一结果提示，血管壁局部ATR的改变可能是高盐负荷导致血管壁重塑的机制之一，减少盐的摄入对预防高血压动脉病变的发生和发展有着重要的意义。

［1］M E Safar，Ch Thuilliez，V Richard，et al.Pressure-independent contribution of sodium to large artery structure and function in hypertension ［J］.Cardiovascular Research，2000，46：269–276.

［2］Serneri G G，Boddi M，Cecioni I，et al.Cardiac angiotensin II formationin the clinical course of heart failure and its relationship with left ventricular function［J］.Circ Res，2001，88（9）：96.

［3］Luis C M，Jia Q H，Helmay M S.Angiotensin AT2Receptor Stimulation Inhibits Early Renal Inflammation in Renovascular Hypertension［J］.Hypertension，2011，57：308-313.

［4］Gu D，Rice T，Wang S，et al.Heritability of blood pressure responses to dietary sodium and potassium intake in a Chinese population ［J］.Hypertension，2007，50（1）：116-122.

［5］Hu J，Jiang X，Li N，et al.Effects of salt substitute on pulse save analysis among individuals at high cardiovascular risk in rural China：a randomized control trail［J］.Hypertens，2009.32（4）：282-288.

［6］孙超峰，高海燕，吕 颖等.高盐摄入对自发性高血压大鼠循环血液中CNP及ET-1的影响［J］.陕西医学杂志，2007，8，36（8）：939-942.

［7］Safar M E，Thuilliez Ch，Richard V，et al.Pressure-in dependent contribution of sodium to large artery structure and function in hypertension［J］.Cardiovascular Research，2000，46：269–276.

［8］Georg N，Kerstin S，Joyg R，et al.Salt Induces Vascular AT1Receptor Overexpression in Vitro and in Vivo［J］.Hypertention，1998，31：1272-1277.

［9］Masahiro Y，Motoi K，Tomohiro O，et al.Vasoconstrictor effect of aldosterone via angiotensin II type 1（AT1）receptor：possible role of AT1receptor dimerization［J］.Cardiovascular Research，2008，79（1）：169-178.