高糖膳食对载脂蛋白AI基因-75 G/A多态性不同基因型健康青年血脂及载脂蛋白比值的影响

宋永燕，欧国进，龚仁蓉，张 珍，胡敏珊，樊 梅，李元昊，方定志

1四川大学华西基础医学与法院学院生物化学与分子生物学教研室，成都 6100412川北医学院基础医学院生物化学教研室，四川南充 6370003四川大学华西医院胸心外科，成都 610041

·论著·

高糖膳食对载脂蛋白AI基因-75G/A多态性不同基因型健康青年血脂及载脂蛋白比值的影响

宋永燕1,2，欧国进1，龚仁蓉3，张 珍1，胡敏珊1，樊 梅1，李元昊1，方定志1

1四川大学华西基础医学与法院学院生物化学与分子生物学教研室，成都 610041
2川北医学院基础医学院生物化学教研室，四川南充 637000
3四川大学华西医院胸心外科，成都 610041

目的探讨高糖膳食对载脂蛋白AI基因(APOA1)启动子区-75 G/A多态性不同基因型健康青年血脂及载脂蛋白比值的影响。方法给予56名平均年龄为(22.89±1.80)岁的健康青年7 d平衡膳食和6 d高糖膳食。平衡膳食的热量组成为15%蛋白质、31%脂肪和54%碳水化合物；高糖膳食的热量组成为15%蛋白质、15%脂肪和70%碳水化合物。于膳食干预的第1天、第8天和第14天清晨抽取12 h空腹静脉血，测定血脂及载脂蛋白浓度，计算甘油三酯(TG)/高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、总胆固醇(TC)/HDL-C、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)/HDL-C及载脂蛋白B100(APOB100)/载脂蛋白AI(APOAI)的比值。提取全基因组DNA，聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性法分析APOA1-75 G/A多态性。结果基础值时，血脂及载脂蛋白比值在男性基因型之间的差异无统计学意义(Pgt;0.05)；在女性中，A等位基因携带者LDL-C/HDL-C显著高于GG基因型受试者(Plt;0.05)。高糖膳食后，TC/HDL-C在各性别和基因型分组中均显著降低(Plt;0.01)。LDL-C/HDL-C在男性各基因型中显著降低(Plt;0.05)；在女性中，LDL-C/HDL-C仅在A等位基因携带者中显著降低(Plt;0.01)，在GG基因型受试者中差异无统计学意义(Pgt;0.05)。结论APOA1 -75 G/A多态性A等位基因可能对其女性携带者的LDL-C/HDL-C比值有一定的影响。

载脂蛋白AI；基因多态性；高糖膳食；血脂及载脂蛋白比值

ActaAcadMedSin, 2012, 34(1):1-7

脂代谢紊乱是导致心血管疾病的主要危险因素之一[1]。临床上一般以低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)作为评估心血管疾病危险性及预后的主要指标，甘油三酯(triglyceride，TG)、总胆固醇(total cholesterol，TC)和/或高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C)作为辅助评价指标。然而，近年来报道与HDL-C相关的血脂比值包括TC/HDL-C、LDL-C/HDL-C和TG/HDL-C与心血管疾病的相关性更为密切，是评价心血管疾病的综合性指标，在预测发病风险度方面优于单纯的血脂水平[2-3]。载脂蛋白B100(apolipoprotein B100，APOB100)/载脂蛋白AI(apolipoprotein AI, APOAI)是另一个最近被广泛报道的比值指数，在预测动脉粥样硬化及冠心病发生的敏感度上可能较其他血脂比值更高[1,4]。

遗传背景和膳食结构是影响血脂的重要因素。然而，目前国内外对与脂代谢密切相关的载脂蛋白基因变异对健康青年血脂比值的影响还少有报道，这些变异与高糖膳食的相互作用及其对血脂及载脂蛋白比值的影响更鲜见报道。本研究分析了高糖膳食与APOA1-75 G/A位点多态性共同对健康青年人血脂及载脂蛋白比值的影响，为不同遗传背景的个体合理选择膳食提供科学依据。

对象和方法

受试对象招募四川大学在校健康大学生60名，男女各30名，均为汉族，年龄20～30岁，平均(22.89±1.80)岁。受试前对所有志愿者进行体检和健康调查，确证无心脑血管疾病史及慢性消耗性疾病史，未服用激素类药物以及其他影响糖、脂代谢的药物。受试前均签署知情同意书。参加本研究的60名志愿者中，4名因个人原因未能完成膳食干预，其余56名按要求完成了整个试验过程，其中男27名，女29名。

高糖膳食受试者在进行高糖膳食前统一食用7 d平衡膳食，以消除招募前各受试对象的膳食差异而导致的误差。平衡膳食的热量组成为15%蛋白质、31%脂肪和54%碳水化合物。平衡膳食结束的第2天立即进行高糖膳食，其热量组成为15%蛋白质、15%脂肪和70%碳水化合物，干预期为6 d。平衡膳食和高糖膳食均由四川大学华西医院营养科配制(表1)。膳食以早餐(07:30～08:30)、午餐(11:30～12:30)和晚餐(17:30～18:30)每天3次提供，对受试者的膳食摄入量不作限制，以自觉饱感为准。在膳食干预期间，所有的受试对象除食用统一配制的膳食及自由饮水外，不得摄入其他食物如零食、水果或饮料。日常生活习惯无限制。

血脂及载脂蛋白测定开始平衡膳食的第1天、第8天和第14天清晨抽取12 h空腹静脉血5 ml。分离血清并立即进行血脂及载脂蛋白测定。酶比色法测定血清TG和TC浓度。磷钨酸-镁沉淀法分离高密度脂蛋白(high-density lipoprotein, HDL)并采用酶法测定HDL-C的含量。聚乙烯硫酸盐沉淀非低密度脂蛋白并用酶法测定非LDL-C的含量，然后用TC减去非LDL-C算出LDL-C的浓度。免疫沉淀法测定APOAI和APOB100。所有指标重复测定3次，平均值用于各血脂及载脂蛋白比值的计算。

APOA1-75G/A多态性分析

DNA提取：基因组DNA分离自外周血白细胞，采用Tiandz公司的血液DNAout试剂盒进行DNA提取，操作过程按试剂盒说明书进行。

PCR扩增含有APOA1-75 G/A位点的DNA片段：PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物序列Forward： 5’-AGGGACAGAGCTGATCCTTGAACTCTTAAG-3’；Reverse：5’-TTAGGGGACACCTAGCCCTCAGGAAGAGCA-3’。PCR反应体系(25 μl)：DNA模板1 μl，上下游引物各1 μl，2×PCR TaqMix 12.5 μl，ddH2O 9.5 μl。PCR扩增程序：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，58℃退火40 s，72℃延伸40 s，循环35次后72℃延伸5 min。

限制性内切核酸酶分析：MspI酶切反应体系(10 μl)：PCR产物1 μl，MspI内切酶(NEB)10 U，10×NEB缓冲液1 μl，ddH2O补至10 μl。37℃水浴16 h后，3%琼脂糖凝胶电泳和溴乙锭-紫外显色鉴定基因型。

统计学处理所有数据采用均数±标准差表示。高糖膳食前后各指标的比较采用配对t检验，不同基因型之间各指标的比较采用独立样本t检验，Hardy-Weinberg平衡采用χ2检验。Plt;0.05为差异有统计学意义。

结 果

APOA1-75G/A多态性基因型及等位基因频率分布-75 G/A位点位于APOA1基因的启动子区域，对该区的扩增片段总长度为434 bp。多态性位点由鸟嘌呤(G)变异成腺嘌呤(A)生成，变异后限制酶MspI的识别序列(5’-C↓CGG-3’)消失，从而失去切割位点。被扩增的DNA片段含3个MspI酶切位点，包括1个固有切点和2个多态性位点。酶切后，GG基因型图谱上含有67 bp和113 bp的2个片段；GA基因型含有67 bp、113 bp和180 bp的3个片段；AA基因型仅含180 bp的片段(图1)。56名受试者中，GG基因型28名，占50%；GA基因型23名，占41.1%；AA基因型5名，占8.9%。主要等位基因G频率为70.5%，次要等位基因A频率为29.5%。基因型和等位基因频率分布均无性别差异。基因频率分布符合Hardy-Weinberg定律(χ2=0.017，P=0.895)。

表 1 平衡膳食和高糖膳食的组成成分

M：标准分子量DNA；1, 2, 4, 6泳道为GG基因型；3, 5, 7泳道为GA基因型M: DNA marker; 1, 2, 4, 6: GG genotype; 3, 5, 7: GA genotype

APOA1-75G/A位点不同基因型受试者血脂及载脂蛋白比值的基础值本研究群体中AA基因型仅有5名，故将GA基因型和AA基因型合并为A等位基因携带者进行统计学分析。在整体受试人群中，所有基础值指标在不同基因型之间差异均无统计学意义。按性别分组后，发现女性受试者中A等位基因携带者LDL-C/HDL-C较GG基因型受试者显著升高(Plt;0.05)(表2)。

APOA1-75G/A位点不同基因型受试者高糖膳食前后血脂及载脂蛋白比值的变化高糖膳食前和高糖膳食后，无论在整体受试人群还是在男女分组中，血脂及载脂蛋白比值在不同基因型之间差异均无统计学意义(Pgt;0.05)。在整体受试人群中，与高糖膳食前相比，高糖膳食后TC/HDL-C(Plt;0.01)和LDL-C/HDL-C(Plt;0.01)在GG基因型受试者和A等位基因携带者中均显著降低；TG/HDL-C和APOB100/APOAI的变化在GG基因型受试者和A等位基因携带者中差异均无统计学意义(Pgt;0.05)。按性别分组后，男性受试者高糖膳食后TC/HDL-C(Plt;0.01)和LDL-C/HDL-C(Plt;0.05)在GG基因型受试者和A等位基因携带者中均显著低于高糖膳食前，TG/HDL-C和APOB100/APOAI的变化在GG基因型受试者和A等位基因携带者中差异均无统计学意义(Pgt;0.05)；女性受试者高糖膳食后TC/HDL-C(Plt;0.01)在GG基因型受试者和A等位基因携带者中均显著低于高糖膳食前，LDL-C/HDL-C仅在A等位基因携带者中显著降低(Plt;0.01)，而TG/HDL-C和APOB100/APOAI在GG基因型受试者和A等位基因携带者中的差异均无统计学意义(Pgt;0.05)(表3)。

表 2 APOA1-75 G/A位点不同基因型受试者血脂及载脂蛋白比值的基础值

表 3 APOA1-75 G/A位点不同基因型受试者高糖膳食前后的血脂及载脂蛋白比值

讨 论

APOAI是HDL的主要载脂蛋白，在胆固醇的逆向转运中发挥重要作用。在体内HDL不仅参与胆固醇的逆向转运，而且具有抗氧化、抗栓塞、抗炎性等生理特性[5-6]，这些特性与其抗动脉粥样硬化的保护机制有关。血浆HDL和APOAI水平降低伴随心血管病发病风险增加[7-8]。APOAI可激活卵磷脂-胆固醇酯酰转移酶(lecithin-cholesterol acyltransferase, LCAT)，此酶在血浆中催化游离胆固醇酯化，促进HDL颗粒的形成和成熟。在APOA1基因内部及周围已发现多个遗传变异位点，其中位于启动子区域的-75 G/A位点研究较多。研究发现A等位基因与APOA1转录活性增强以及APOAI和HDL的血浆浓度升高关系密切[9-12]，提示A等位基因可能是心血管疾病的保护性遗传因素。但在西班牙的一项病例对照研究[13]中，研究人员发现A等位基因频率在男性心肌梗塞患者中显著高于健康对照组，这说明A等位基因对心血管疾病的遗传效应可能与种族、性别及年龄相关。

本研究中，基础比值TG/HDL-C、TC/HDL-C、LDL-C/HDL-C和APOB100/APOAI在男性不同基因型之间的差异无统计学意义，但女性A等位基因携带者LDL-C/HDL-C显著高于GG基因型受试者，提示在我国青年女性中A等位基因是升高LDL-C/HDL-C比值的遗传因素。高糖膳食后，TC/HDL-C在所有受试者中均显著降低，可能是因为在我国青年群体中，高糖膳食对TC/HDL-C的降低幅度较大，掩盖了不同遗传背景及性别的影响。我国是一个以淀粉类食物为主的国家，与欧美国家相比我国人群的血脂组成较为理想，心血管病的发病率也相对较低[14-15]。中国人群在长期的进化中可能已对淀粉类食物产生了适应性，表现为高糖膳食干预后TC/HDL-C大幅降低。

在本研究组前期的研究中，发现整体受试人群高糖膳食后TC和LDL-C显著降低、TG和HDL-C显著升高[16]，以及TC/HDL-C和LDL-C/HDL-C比值显著降低[17]。本研究按性别和APOA1-75 G/A多态性分组分析后发现，TC/HDL-C在各亚组中均显著降低，而LDL-C/HDL-C仅在男性组各基因型及女性A等位基因携带者中显著降低，在女性GG基因型受试者中的差异无统计学意义。基础值时，女性A等位基因携带者LDL-C/HDL-C显著高于女性GG基因型受试者，高糖膳食后LDL-C/HDL-C在女性A等位基因携带者中显著降低，在女性GG基因型中没有明显变化。结果提示，APOA1-75 G/A多态性A等位基因可能对其女性携带者的LDL-C/HDL-C比值有一定的影响。

在本研究中，基础值时女性A携带者的LDL-C/HDL-C比值显著高于GG基因型受试者；高糖膳食后LDL-C/HDL-C比值的变化在女性A携带者中有统计学意义，而在女性GG基因型受试者中差异无统计学意义。阳性结果都出现在女性中，这可能与女性具有较高的雌性激素水平密切相关。雌性激素显著影响脂蛋白酯酶的活性[18]。体外实验中，Rinninger等[19]研究发现脂蛋白酯酶促进肝细胞对HDL中胆固醇酯的选择性吸收，具有降低循环中HDL-C的作用。女性雌性激素水平较高，对脂蛋白酯酶的活性影响较强，也较强地影响着肝细胞对HDL中胆固醇酯的摄取和降解。APOAI是HDL的重要组成部分，也是血浆脂蛋白、尤其是HDL代谢的重要调节因素。在具有较高雌性激素水平的女性中，APOA1-75 G/A多态性更容易对高糖膳食诱导的LDL-C/HDL-C比值变化产生影响。至于还有无其他因素使本研究阳性结果仅出现在女性，有待进一步研究。

综上所述，高糖膳食对我国健康青年APOA1-75 G/A多态性不同基因型受试者的血脂比值有调节作用，且这种调节作用主要体现在女性受试者中。该结果还需在多个种族、更多人群及大样本的研究中进一步证实，以为具有不同遗传背景的个体合理选择膳食提供依据。

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EffectsofaHigh-carbohydrateDietontheSerumLipidandApolipoproteinRatiosinHealthyYoungAdultswithDifferentGenotypesofAPOA1-75G/APolymorphism

SONG Yong-yan1,2, OU Guo-jin1, GONG Ren-rong3, ZHANG Zhen1,HU Min-shan1, FAN Mei1, LI Yuan-hao1, FANG Ding-zhi1

1Department of Biochemistry and Molecular Biology Laboratory, West China School of
Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University, Chengdu 610041, China
2Department of Biochemistry, School of Preclinical Medicine, North Sichuan Medical College,
Nanchong, Sichuan 637007, China
3Department of Cardiac and Thoracic Surgery, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, China

FANG Ding-zhi Tel: 028-85471567, E-mail: dzfang@scu.edu.cn

ObjectiveTo investigate the effects of a high-carbohydrate diet on the lipid and apolipoprotein ratios in healthy young adults with different genotypes of the polymorphism at -75 site in the promoter region of the gene of apolipoprotein AI (APOA1).MethodsFifty-six subjects aged (22.89±1.80) years were given a wash-out diet for 7 days, followed by a high-carbohydrate diet for 6 days. The wash-out diet contained 15% protein, 31% fat, and 54% carbohydrate. The high-carbohydrate diet contained 15% protein, 15% fat, and 70% carbohydrate. Twelve-hour fasting serum lipids and apolipoproteins B100 and AI were measured on the mornings of the 1st, the 8th, and the 14th days from the beginning of the wash-out diet. The ratios of triglyceride (TG)/high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C), total cholesterol (TC)/HDL-C, low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C)/HDL-C, and apolipoprotein B100 (APOB100)/apolipoprotein AI (APOAI) were calculated. The genome DNA was extracted and the polymorphism of APOA1-75 G/A was determined by polymerase chain reaction followed by restriction fragment length polymorphism assay.ResultsAt baseline, the lipid and apolipoprotein ratios showed no significant differences between the GG genotype and the A carriers in males (Pgt;0.05), whereas the female A carriers had a significantly higher ratio of LDL-C/HDL-C compared with the female subjects with the GG genotype (Plt;0.05). Following the high-carbohydrate diet, significant decreases of TC/HDL-C were found in all the groups, regardless of sex and genotype (Plt;0.01). LDL-C/HDL-C experienced significant decreases in both the genotypes in males (Plt;0.05), while in females, significant decrease of LDL-C/HDL-C was only observed in A carriers (Plt;0.01).ConclusionThe A allele of the -75 G/A polymorphism in APOA1 may have specific effects on the LDL-C/HDL-C ratio in females.

apolipoprotein AI; gene polymorphism; high-carbohydrate diet; lipid and apolipoprotein ratios

方定志 电话：028-85471567，电子邮件：dzfang@scu.edu.cn

R713.8

A

1000-503X(2012)01-0001-07

10.3881/j.issn.1000-503X.2012.01.001

教育部新世纪优秀人才支持计划(NCET-04-0863)Supported by the Program for New Century Excellent Talents in Universities in China (NCET-04-0863)

2011-05-10)