以225名健康儿童建立呼出气一氧化氮正常值

刘媛媛 陆燕红 郝创利

支气管哮喘是儿童最常见的慢性疾病之一，其病理基础是慢性气道炎症。国际上公认的评价气道炎症的金标准是支气管活检和肺泡灌洗液中的嗜酸粒细胞(EOS)计数，但具有创伤性，不宜反复测定，而肺功能与气道炎症的相关性并不显著。呼出气一氧化氮(FeNO)作为一种简单、无创的气道炎症检测方法是近年来研究的热点。目前欧美以及亚洲大部分国家和地区均依据美国胸科学会/欧洲呼吸学会(ATS/ERS)制订的“一氧化氮呼气测定指南”［1］进行FeNO检测，并依据Taylor等［2］推荐的儿童和成人FeNO的正常参考值进行结果判定。但该正常参考值是否适合中国儿童，尚无数据支持。鉴于FeNO在气道炎症性疾病中的临床应用价值，有必要及早对中国儿童进行调查，规范其结果判断和临床检查方法，以期为临床诊断提供依据。

1 方法

1.1 研究现场及时间 选取苏州市1所小学和中学的6～14岁汉族儿童为研究对象进行调查，工作时间为2010年10～11月。

1.2 问卷调查 对2所学校的儿童监护人发放知情同意书，同意参加调查者统一发放调查问卷。内容包括:①一般情况:姓名、性别、年龄、籍贯、出生地和民族;②采集身高和体重指标:赤脚站立测量身高，精确至0.5cm;着单衣测体重，精确至0.5 kg;③吸烟和被动吸烟;④纳入标准中定义的疾病史、近2周呼吸道感染情况和近4周糖皮质激素使用情况。

1.3 纳入标准 ①体重、身高均在正常范围内(体重及身高标准参照文献［3］);②问卷调查提示既往无慢性支气管炎、支气管扩张、支气管哮喘、过敏性鼻炎、鼻窦炎、遗传性过敏症、呼吸睡眠障碍综合征、间质性肺炎、肺结核和胸膜炎等病史;③问卷调查提示无吸烟或被动吸烟史;④问卷调查显示近2周内无上或下呼吸道感染史;⑤问卷调查提示检测近4周内未使用过糖皮质激素;⑥肺功能检查指标(FEV1、FEV1/FVC)正常;⑦外周血 EOS计数＜0.04。

问卷调查结果汇总后，符合纳入标准定义①～④项的儿童在问卷调查结束1周后行FeNO、肺功能和外周血EOS计数检测，检测的工作时间为1周。

1.4 FeNO测定方法 在室内进行，无花木、明显灰尘、墙壁涂料及其他装饰品的异味;测试前2h内及测试期间室内禁止吸烟;室内保持温度在20～28℃、相对湿度在20%～60%。采用电化学法eNO测定系统(Niox Mino eNO分析仪，瑞典Aerocrine公司)测定FeNO。FeNO测定由苏州大学附属儿童医院(我院)呼吸科医生根据2005年ATS/ERS指南进行操作。测试时间均在上午8～12时，检测FeNO前1h内禁食，禁喝咖啡、茶、碳酸和豆浆类饮料或过冷及过热饮水，无剧烈运动。测试体位采取坐位，要求儿童坐直，头保持自然水平。测试前向儿童解释并演示测定方法，呼气流速设定为50mL·s-1。呼出时间为10 s，10岁以下或身高低于130cm或连续3次不能持续呼出10 s的儿童，采用6 s呼出时间，测试时间平台为呼出中期的2～3 s，每名儿童测试1次，测试结果以ppb(parts per billion)为单位。若连续6次呼出速度均未满足测试要求，则从第7次开始记录为测试依从性差;若连续9次测试仍未完成满意的呼吸，定义为测试失败。

1.5 肺功能测定方法 在FeNO测定结束后进行，采用MasterScreen肺功能仪(德国Jaeger公司)进行测定。在检测前均进行肺功能仪的校正，检测前向儿童解释并演示测定方法，按测定要求进行测试。重复测定3～8次，取FEV1、FEV1/FVC的最大值。

1.6 外周血EOS计数FeNO及肺功能测定结束后集中在学校卫生室抽取外周血置于抗凝管中，2h内送至我院检验科采用血细胞自动分析仪检测外周血EOS计数。

1.7 统计学分析 正态性检验采用Kolmogorov-Smirnov法，偏态分布数据自然对数转换后进行分析。正常参考值计算采用±1．96s或eln)±1.96ln(s)。采用Pearson相关分析身高、体重、肺功能、外周血EOS计数和FeNO的相关性。分析＞9岁和≤9岁儿童FeNO的差异，(P＜0.05)为差异有统计学意义。采用SPSS 16.0软件进行统计分析。

2 结果

2.1 一般情况 参加问卷调查的450名儿童，172名因近2周有呼吸道感染史或既往有过敏性疾病史、24名有被动吸烟史而被排除，余254名行FeNO、肺功能和外周血EOS计数检测。252/254名(99.2%)记录完成满意呼吸时测得的FeNO值，其中达到满意呼吸时呼出次数≤3次206名(81.1%)，～6次40名(15.7%)，≥7次6名(2.4%)，检测过程中无儿童出现身体不适。225名健康儿童(男生107人，女生118人)符合纳入标准进入分析(图1)，一般情况见表1。

图1 健康儿童筛选流程图Fig 1 Flow chart ofhealthy children selection process

表1 纳入儿童的一般情况±s)Tab 1Basic characteristics of enrolled subjects±s)

表1 纳入儿童的一般情况±s)Tab 1Basic characteristics of enrolled subjects±s)

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2.2 FeNO正常值 达到满意呼吸平均需呼出2.3次(1～8次)，且呼出次数与FeNO检测结果无关(P=0.336)。

FeNO值呈偏态分布，自然对数转换后呈正态分布。225名健康儿童的FeNO平均值为11 ppb(95%CI:5～28 ppb)，最小值＜5 ppb，最大值为83 ppb。男生FeNO平均值为11 ppb(95%CI:5～31 ppb)，女生FeNO平均值为11 ppb(95%CI:5～25 ppb)。

2.3 FeNO的相关因素分析FeNO水平与外周血EOS计数相关性最显著(r=0.291，(P＜0.001))，与身高(r=0.148，P=0.027)、FEV1(r=0.138，P=0.038)显著相关;＞9岁儿童FeNO显著高于≤9岁儿童(12 ppb vs 10 ppb，P=0.002);与性别、体重、BMI、FEV1/FVC均无显著相关性。

3 讨论

本调查中6～14岁儿童FeNO检测成功率高达99.2%。Buchvald等［4］报道FeNO检测成功率在4岁儿童中为40%，而在学龄儿童中达到80%～100%。1999年ATS指南指出［5］，对于12岁以下的儿童，测试时间平台为呼出中期的2 s，最少呼气时间为4 s。本研究为了提高FeNO检测的可行性，10岁以下儿童或身高低于130cm或连续3次不能持续呼出10 s者，采用6 s呼出时间，测试时间平台为呼出中期的2～3 s。

目前国内尚未制定中国儿童FeNO的正常参考值，根据本次调查结果初步显示，苏州地区6～14岁儿童FeNO正常值范围为5～28 ppb。这一数值较目前欧美大部分国家以及亚洲的日本、新加坡和中国台湾地区所采用的Taylor等［2］推荐值高。Taylor等［2］推荐儿童 FeNO 水平5～19 ppb为正常，20～34 ppb为偏高，≥35 ppb为较高。其原因一方面考虑可能与种族相关，已有文献报道不同种族人群的FeNO水平存在差异，亚洲及非洲人群FeNO水平整体要高于白种人。Kovesi等［6］对657名9～12岁加拿大健康儿童的调查显示，亚裔儿童FeNO水平(平均值为22.8 ppb，95%CI:17.9～27.7 ppb)高于白人儿童(平均值为12.7 ppb，95%CI:11.8～13.7 ppb)。Wong等［7］的小样本调查发现香港地区华人儿童FeNO正常值比欧美儿童高。推测FeNO水平可能与遗传相关，这可能与NO合成酶多态性、IgE水平有关系，需待更多的研究进一步探讨;另一方面考虑与本次调查的样本量较小有关，需待今后更大样本的调查以明确。结合相关文献与本次调查的结果，推测华裔儿童FeNO的正常值可能稍高于欧美儿童，因此有必要对中国各地区儿童的FeNO水平进行多中心调查，以建立适合中国儿童的FeNO正常参考值。

本次调查显示在正常儿童中FeNO水平与外周血EOS计数呈显著的正相关。目前在正常儿童中关于外周血EOS计数对FeNO水平影响的报道尚不多，但对于哮喘患者，多项研究已证实FeNO与外周血EOS计数具有显著的相关性，FeNO能较好地反映嗜酸性炎症水平。目前也有多项研究认为特应质与 FeNO存在正相关。Malmberg等［8］报道FeNO升高与特应质相关(OR=9.0，(P＜0.001))，其中与变应性鼻炎、特应性皮炎显著相关，而与哮喘诊断无显著相关。无呼吸道症状但皮肤过敏原点刺试验阳性的儿童FeNO水平显著高于无过敏症状的健康儿童。另有研究［9，10］认为，急性变应原暴露可能会影响 FeNO水平，故在进行FeNO测定时，对可疑受试者需考虑有过敏性鼻炎的可能。

本研究结果显示，FeNO水平与儿童身高呈正相关，与国内外相关报道结论基本一致。Malmberg等［8］对芬兰学龄儿童调查显示，身高是与FeNO最相关的独立影响因素，当身高为120～180cm，根据回归方程FeNO变化范围为7～14 ppb。Buchvald等［4］对 4～17岁儿童的调查也发现，当年龄、特应质及种族条件均一致的情况下，美国儿童的FeNO水平高于欧洲儿童，而美国儿童的身高及体重亦明显高于欧洲儿童，在一定程度上可以解释美国儿童较欧洲儿童FeNO水平偏高的原因。

本调查同时发现，FeNO水平与肺功能参数FEV1有较弱的相关性(r=0.138，P=0.038)，但与FEV1/FVC无相关性，且与性别、体重、BMI均无相关性。Malmberg等［8］的调查显示FeNO与FEV1、FVC呈正相关，但与FEV1/FVC无相关性。在1项对100名健康儿童的研究发现，FeNO与FEV1、FEV1/FVC 间无显著相关性［11］。而 Liu 等［12］对中国台湾正常成人调查显示，FeNO与FEV1/FVC呈正相关，而与呼气峰流速(PEF)日内变异率无相关性。本调查显示性别与儿童FeNO水平无相关，这一结论在多项研究［4，8，13，14］中均有报道。然而对于成人，大多数研究表明女性的FeNO水平较男性低［15，16］。FeNO水平的性别差异可能与气道表面积和直径相关，女性气道腔隙较小，可导致女性FeNO水平较低。Buchvald等［4］对4～17岁儿童调查认为FeNO水平与年龄呈正相关，平均每增长1岁即增加1 ppb。Linn等［17］对美国南加州2 568名7～10岁的学龄儿童FeNO值调查显示，9岁以上儿童的FeNO水平明显高于9岁以下儿童。Yao等［18］对中国台湾1 717名5～18岁儿童调查发现，FeNO水平具有年龄相关性，平均每岁增加7.4%。本研究显示＞9岁儿童FeNO显著高于≤9岁儿童，与上述文献报道较为一致。Gabriele等［19］报道婴幼儿FeNO值与胎龄及出生体重相关。ATS/ERS指南亦提示11岁以下儿童FeNO水平与年龄和体表面积有关。儿童FeNO水平的这种年龄依赖性可能与儿童生长发育特点有关，随着年龄的增加，儿童肺活量及气道表面积渐增大，使气道NO弥散系数发生改变［20］;但也有可能与反复的免疫刺激下诱导型NO合酶增加有关［21］。同时本研究FeNO检测时对于不同年龄、不同大小的气道呼气流速均设定为50mL·s-1，因此对于小年龄的儿童来说，固定的呼气流速相对偏大，这也许从另一方面可以解释FeNO水平的年龄依赖性［22］。然而年龄本身也许并不影响FeNO水平，因为其他因素如体重、身高以及体表面积均与年龄相关，且FeNO检测的成功率及儿童的依从性亦与年龄密切相关。FeNO水平与体重的相关性尚无定论。本调查中儿童体重与FeNO无相关性(r=0.110)。而Linn等［17］的调查表明，在身高相同情况下，体重与FeNO呈负相关。Yao等［18］的调查表明FeNO水平与儿童BMI呈负相关，平均每增加1个BMI单位FeNO减少约1.5%。此外，FeNO水平还受吸烟、饮食、运动、环境中NO浓度及测定时间等因素的影响，本研究尽可能规避了上述因素的影响，故结果受上述因素的影响可能不大。

本研究的不足之处和局限性:①本研究由于要采集外周血测定EOS计数，部分儿童监护人不同意参加研究，影响了样本量。②本研究将外周血EOS计数＜0.04作为纳入标准，以除外过敏性疾病尚显不足，血过敏原检测的结果可能更为准确。

［1］American Thoracic Society， European Respiratory Society.ATS/ERS recommendations for standardized procedures for the online and offline measurement of exhaled lower respiratory nitric oxide and nasal nitric oxide，2005.Am J Respir Crit Care Med，2005，171(8):912-930

［2］Taylor DR，Pijnenburg MW，Smith AD，et al.Exhaled nitric oxide measurements:clinical application and interpretation.Thorax，2006，61(3):817-827

［3］Li H(李辉)，Ji CY，Zong XN，et al.Height and weight standardized growth charts for Chinese children and adolescents aged 0 to 18 years.Chin J Pediatr(中华儿科杂志)，2009，47(7):493-498

［4］Buchvald F，Baraldi E，Carraro S，et al.Measurements of exhaled nitric oxide inhealthy subjects age 4 to 17 years.Allergy Clin Immunol，2005，115(6):1130-1136

［5］Recommendations for standardized procedures for the on-line and off-line measurement of exhaled lower respiratory nitric oxide and nasal nitric oxide in adults and children-1999.This official statement of the American Thoracic Society was adopted by the ATS Board of Directors，July 1999.Am J Respir Crit Care Med，1999，160(6):2104-2117

［6］KovesiT， Kuika R， Dales R. Exhaled nitric oxide concentration is affected by age，height，and race inhealthy 9 to 12-year-old children.Chest，2008，133(1):169-175

［7］Wong G，Liu E，LeungT，et al.High levels and genderdifference of exhaled oxide in Chinese schoolchildren.Clin Exp Allergy，2005，35(7):889-893

［8］Malmberg LP，PetaysT，HaahtelaT，et al.Exhaled nitric oxide inhealthy nonatopic school-age children:determinants andheight-adjusted reference values.Pediatr Pulmonol，2006，41(7):635-642

［9］Henriksen AH，Sue-Chu M，Lingaas HT，et al.Exhaled and nasal NO levels in allergic rhinitis:relation to sensitization，pollen season and bronchial hyperresponsi veness.Eur Respir J，1999，13(2):301-306

［10］Khalili B，Boggs PB，Shi R，et al.Discrepancy between clinical asthma control assessment tools and fractional exhaled nitric oxide.Ann Allergy Asthma Immunol，2008，101(2):124-129

［11］Shu LH(舒林华)，Shang YX，Yang N，et al.The correlation between fraction of exhaled nitric oxide and lung function inhealthy children.Chin Pediatr Emerg Med(中国小儿急救医学杂志)，2009，16(4):154-156

［12］Liu HC，Hsu JY，Cheng YW，et al.Exhaled nitric oxide in a Taiwanese population:age and lung function as predicting factors.Formos Med Assoc，2009，108(10):772-777

［13］］Franklin PJ，Turner S，Le Souef PN，et al. Exhaled nitric oxide and asthma: complex interactions between atopy， airway responsiveness，and symptoms in a community population of children. Thorax，2003，58( 12) : 1048-1052

［14］Franklin PJ，Dingle P，Stick S.Raised exhaled nitric oxide inhealthy children is associated withdomestic formaldehyde levels.Am J Respir Crit Care Med，2000，161(5):1757-1759

［15］Tsang KW，Ip SK，Leung R，et al.Exhaled nitric oxide:the effects of age，gender and body size.Lung，2001，179(2):83-91

［16］Tim JT Southerland，Taylor DR，Sears MR，et al.Association between exhaled nitric oxide and systemic inflammatory markers.Ann Allergy Asthma Immunol，2007，99(6):534-539

［17］Linn WS，Rappaport EB，Berhane KT，et al.Exhaled nitric oxide in a population-based study ofSouthern California schoolchildren.Respir Res，2009，10(1):28

［18］YaoTC， Ou LS， Lee WI， et al.Exhaled nitric oxidediscriminates children with and without allergic sensitization in a population-based study.Clin Exp Allergy，2011 ，41(4):556-564

［19］Gabriele C， vanderWielEC， NieuwhofEM， etal.Methodological aspects of exhaled nitric oxide measurements in infants.Pediatr Allergy Immunol，2007，18(1):36-41

［20］Latzin P，Beck J，Griese M.Exhaled nitric oxide inhealthy children:variability and a lack of correlation with atopy.Pediatr Allergy Immunol，2002，13(1):37-46

［21］Avital A，Uwyyed K，Berkman N，et al.Exhaled nitric oxide is age-dependent in asthma.Pediatr Pulmonol，2003，36(5):433-438

［22］Silkoff PE，McClean PA，Slutsky AS，et al.Marked flowdependence of exhaled nitric oxide using a new technique to exclude nasal nitric oxide.Am J Respir Crit Care Med，1997，155(1):260-267