乳酸菌的分离与筛选试验

2012-11-20王静山东省单县畜牧局273700

山东畜牧兽医 2012年9期

关键词：产酸沙门氏菌菌种

王静（山东省单县畜牧局 273700）

乳酸菌的分离与筛选试验

王静（山东省单县畜牧局 273700）

本试验对复筛得到的3个乳酸菌菌株LS-3、LS-9、LS-15进行抑菌效果、耐药性和产酸能力试验。结果表明，3种乳酸菌对有害微生物有拮抗作用，耐酸性强，有较强的存活力，受抗生素药物的干扰小，无毒无副作用，具有较好的应用前景。

乳酸菌腹泻筛选

乳酸菌是肠道的正常菌群之一，它对肠道内多种微生物群落有一定调整作用，作为益生素菌种在肠道内生长繁殖，改善肠道环境，尤其在预防和治疗由大肠杆菌等引起的兽禽腹泻等消化系统疾病，具有较好的作用，从而提高兽禽的成活率，并可促进兽禽生长。本研究中通过不同的实验筛选，试验结果如下。

1 材料与方法

1.1 供试培养基

1.1.1 分离培养基 BCP培养基：酵母膏2.5g、蛋白胨5g、葡萄糖5g、溴甲酚紫0.04g、琼脂15g、蒸馏水1000ml，pH6.8~7.0。淘米水液体培养基：糯米:水=1:2，浸泡3d后，过滤，灭菌后备用。

1.1.2 产酸培养基葡萄糖10g、MgSO4·7H2O 1g、蛋白胨2g、酵母膏5g、NaCl 1g、蒸馏水1000ml、pH7.0~8。

1.1.3 鉴别培养基形态观察用BCP平板培养基。糖的氧化和发酵培养基：蛋白胨1.0g、NH4H2PO41.0g、KCl 0.2g、 MgSO4·7H2O 0.2g、溴百里酚蓝(1.6%酒精溶液)1.5ml、琼脂3.0g、蒸馏水1000.0ml。

1.2 菌种的分离与纯化

1.2.1 标样的来源新鲜猪结肠内容物、活鸡肠道内容物置入无菌生理盐水稀释，吸取5ml置入95ml富集培养基厌氧培养48h，如此连续5次进行的富集培养液备用；新鲜西红柿在无菌淘米水液体培养基中厌氧富集培养48h，如此连续3次进行的富集培养液备用的培养液备用。

1.2.2 菌株的分离将不同的标样溶液分别系列稀释，涂布于BCP平板上，挑取有透明圈的菌落，反复纯化至纯种挑至牛奶试管中保存。

1.2.3 初筛将分离得到的纯化菌株接种于液体产酸培养基中，37℃厌氧培养48h，用标定的0.01N氢氧化钠溶液滴定，挑选相对产酸量高的菌株。

1.2.4 复筛以弱毒型大肠杆菌(E. coli)作为试验菌，将初筛菌种的发酵液离心后，取上清液用杯蝶法测其抑菌活性，保留具有抑菌活性的菌株。

1.2.5 乳酸菌鉴定据伯杰氏细菌鉴定手册对乳酸菌的描述，将筛选确定的G+菌株进行接触酶试验和菌悬液接种于糖发酵培养基试管中，观察反应结果。并用从中国农业微生物菌种保藏管理中心购买的标准菌株Accc10644(植物乳杆菌)，Accc10637(嗜酸乳杆菌)，Accc10180(粪链球菌)作对照。

1.2.6 抑菌谱的测定分别以革兰氏阴性菌弱毒型猪霍乱沙门氏菌（Salmonella C500）、强毒型鸡白痢沙门氏菌（Salmonella C79-13），革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），单核细胞增生利斯特氏菌（Listera monocytogenes 54002），热带产朊假丝酵母和啤酒酵母（Saccharomaces cerevisiae）作为试验菌，用管碟法测定复筛确定的菌株对上述供试菌株的抑菌作用。

1.2.7 抗药性的测定采用牛津杯法。预先将复筛确定的菌株分别涂BCP平板，牛津杯置于平板上。分别取土霉素、PPA、黄连素（浓度均为800IU/ml）、青霉素钠盐(浓度为1000IU/ml)0.2 ml置于牛津杯中。

2 结果与分析

2.1 菌种的确定

从不同来源材料中，共分离得到纯培养菌株56株。其中G染色结果为阳性、KOH试、H2O2酶试验、明胶水解试验、产硫化氢试验均为为阴性的有29株，确定为乳酸菌，将其编号从LS-1到LS-29。

2.2 菌株的筛选

通过产酸能力的检定和对猪源弱毒型大肠杆菌有抑制效果的比较，LS-3、LS-9、LS-15三个菌株产酸能力较强，对E. coli的抑菌圈的直径(mm)分别为：18.2±2、15.8 ±1、19.3±2.3。因此，选择其中抑菌活性较强的3个菌株作为进一步研究材料。

2.3 复筛菌株的鉴定

生化试验结果见表1。

表1 生化微量管鉴定结果表

由表1可以判断，所筛选出的3株菌株均为乳酸菌，其中，LS-3为嗜酸乳杆菌，LS-15为植物乳杆菌，LS-9为乳酸球菌。

2.4 抑菌谱测定

复筛出的3株菌株对供试菌株的抑制作用见表2。

表2 不同菌株抑菌效果(抑菌圈直径) (mm)

由表2可以看出，3个菌株对所供试的禽畜上常见的腐败菌和病原菌均具有明显的抑制作用，这其中包括G+的金黄色葡萄球菌、单核细胞增生利斯特氏菌及G-猪霍乱沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌均有较好的抑制作用，其中乳酸球菌的作用又略好于两乳酸杆菌。同时，三个菌株对热带产朊假丝酵母、啤酒酵母又均表现出无抑制作用。因此，可将同样具有益生素效果的热带产朊假丝酵母、啤酒酵母添加进去，进行多菌株混合培养，以达最大产量。