应用激流式生物反应器大规模悬浮培养昆虫细胞(sf9)的工艺研究

赵立民 蒋天华 罗乃杰 （广东温氏食品集团有限公司研究院 广东 新兴 527400）



应用激流式生物反应器大规模悬浮培养昆虫细胞(sf9)的工艺研究

赵立民 蒋天华 罗乃杰 （广东温氏食品集团有限公司研究院 广东 新兴 527400）

应用激流式生物反应器对大规模悬浮培养sf 9细胞的工艺进行了研究，通过摸索细胞接种密度、溶解氧(DO)、反应器转速3项工艺参数，成功实现了sf 9细胞的大规模悬浮培养，细胞密度最高可达到0.8~1.5×106/ml，生长状态良好。

激流式生物反应器 sf 9细胞 接种密度 DO 转速

sf 9细胞由G.E. Smith和C.L. Cherry在1983年从细胞株IPLB-SF 21 AE得来的一个克隆，是目前国际上常用的细胞株之一，可作为猪圆环病毒(PCV)等多种病毒的宿主细胞，用于生产兽用疫苗，也可用于昆虫细胞/杆状病毒表达系统，制备各种农业杀虫剂等，用途广泛[1]。相比哺乳动物细胞，昆虫细胞对生长环境要求苛刻，所需培养液营养丰富，添加的血清须是高质量的胎牛血清[2]。细胞本身娇弱，对剪切力敏感，较难以反应器发酵的方式进行大规模培养。激流式生物反应器是目前国内新兴的一次性生物反应器，具有剪切力小、控制精准、操作简单、规模易放大等特点。本文采用该反应器，通过对相关工艺参数的摸索，进行了sf 9细胞大规模悬浮培养工艺的实验研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系 sf 9昆虫细胞，购自武汉生物所，100~150代。

1.1.2 细胞培养液 Grace干粉培养基(Gibco)，每升添加0.35gNaHCO3、1.3g水解乳蛋白、3g酵母提取物，用Millipore超纯水溶解，稀HCl调节pH至6.2后，0.22mm滤芯除菌过滤；使用时添加10%热灭活胎牛血清(Hyclone)。

1.1.3 检测试剂 葡萄糖检测试剂盒(南京建成)

1.1.4 主要设备 激流式生物反应器(AP20型，杭州安普生物工程有限公司)，细胞计数仪(Count Start)，紫外分光光度计(国产美谱达)。

1.1.5 其他 压缩空气、CO2。

1.2 方法

激流式反应器可以通过自动控制方式调节各项培养参数，让细胞的生长环境始终处于一种稳定状态，与平板静态培养的主要区别在于反应器转速、DO、接种密度等的不同。sf 9细胞的平板培养工艺较为成熟，其确定的某些常规参数可直接应用于反应器，如培养温度28℃，pH6.2[3]。现在需要摸索分析的是接种密度、反应器转速、DO3项工艺参数。

反应器悬浮培养sf 9细胞的主要流程为：调好反应器的各项参数，将摇瓶中处于对数生长期，状态良好的sf 9细胞应用细胞计数仪计数，计算接种量后，无菌接种至反应器内，初始培养体积为1L。细胞接种后每隔24h取样1次，进行细胞计数，观察细胞状态，测定葡萄糖含量，并根据样品的检测结果补加新鲜培养基，直至总培养体积5L为止。

1.2.1 细胞接种密度梯度试验 将细胞接种密度分为低密度(0.2×105cells/ml)、中密度(1.0×105cells/ml)、高密度(5.0×105cells/ml)三个梯度，其他工艺参数设置为培养温度28℃，pH6.2，转速40rpm，DO60%，进行sf 9细胞的反应器大规模培养，观察在不同细胞接种密度情况下的细胞生长情况。

1.2.2 转速梯度实验 将转速分为低转速(30rpm)、中转速(50rpm)、高转速(80rpm)三个梯度，其他工艺参数设置为培养温度28℃，pH6.2，DO50%，细胞接种密度1.0× 105cells/ml，进行sf 9细胞的反应器大规模培养，观察在设置不同转速情况下的细胞生长情况。

1.2.3 DO梯度实验 将DO分为低DO(30%)、中DO (60%)、高DO(90%)三个梯度，其他工艺参数设置为培养温度28℃，pH6.2，转速50rpm，细胞接种密度1.0×105cells/ml，进行sf 9细胞的反应器大规模培养，观察在设置不同DO情况下的细胞生长情况。

2 结果

2.1 细胞接种密度梯度 如图1，在低密度接种情况下，细胞生长缓慢，尤其在细胞生长前期。在高密度接种情况下，生长前期增殖迅速，但随后生长速度趋缓。在中密度接种情况下，细胞也能较快的进入对数生长期，而且曲线平稳，在生长后期甚至可超过高密度接种，细胞状态良好。考虑到细胞种准备工作等因素，确定中密度接种参数较优。

2.2 反应器转速梯度 如图2，在低转速条件下，整个培养流程中细胞生长数量均低于其他两种方式，后期取样镜检有较多细胞粘连现象。在高转速条件下，细胞前期生长情况正常，但是中后期的生长速度明显低于中转速，并且取样的培养液中细胞碎片较多。中转速条件下细胞生长速度正常，镜检状态良好，确定中转速参数较优。

2.3 DO梯度 如图3，在3种梯度DO的条件下，细胞生长情况正常，曲线走向基本一致，无明显的变化。

图1

图2

图3

(注：上述3图中，纵轴表示反应器内的细胞总量，单位(×108 cells)，横轴为培养天数，单位d)

3 讨论

3.1 密度与生长关系 细胞有群体生长优势的特点，不断分泌有益于本身的物质，如促生长因子等，营造对本身生长的有利环境。所以，细胞接种密度的高低，将直接影响进入对数生长期的时间。有文献报道，sf 9细胞的平板接种密度若低于104cells /ml，细胞甚至不会正常生长[3]。细胞在分泌有益物质的同时，还会排泄有害的代谢产物，如氨、乳酸等[4]。这些代谢产物的不断积累，对细胞的生长会产生消极影响。所以细胞高密度接种的最终效果不一定能够达到最优。

3.2 转速与细胞增殖 激流式生物反应器没有搅拌桨，运行时以整体摇动的方式带动其内部的培养液摇动，从而达到混和、溶氧的效果。该种混合方式剪切力相应降低，溶氧效率更高。Sf 9细胞的个体体积较大，本身脆弱，易受剪切力的影响。从图3中可以看出，在高转速条件下，早期由于细胞密度较低，高转速产生的高剪切力只对少量的细胞产生不利影响，细胞生长尚正常，但随着细胞的不断增殖，高剪切力的破坏力也越大。另外高转速产生的培养液泡沫更多，其破裂产生的表面张力对细胞也有很大的破坏力。在两方面作用下，部分细胞死亡，分裂后的细胞碎片又对正在生长的细胞产生不利影响，如此反复循环，导致培养后期的活细胞密度反而不高，培养液中杂质增多。在低转速时，剪切力虽然更低，但由于低转速的混合效果不好，营养难以均一，溶氧不充分，细胞生长状况并不理想。同时低转速也令细胞的分散度降低，细胞结团的现象增多。中转速则兼顾了混合均一与低剪切力的优势，同时满足了溶氧要求，保证细胞的正常快速增殖。

3.3 DO梯度与细胞形态 Sf 9对溶解氧浓度的要求方面与哺乳动物细胞相似，只要保证其最低溶解氧浓度，即可进行正常的生长代谢活动，即使将DO提升至90%，对细胞的增值时间并没有产生显著影响。在实验中我们也发现，根据细胞密度的不同，细胞培养所需的最低DO也会不同。细胞密度越高，所需的最低DO也将相应上升。如果低于所需的最低DO，生长速度将很快下降，甚至停止。由于没有做高DO对sf 9细胞生理代谢方面影响的实试验，根据以往其他细胞大规模培养的经验，可将反应器培养sf 9细胞的DO设定在50%~60%。

本试验中，作为反应器供氧的来源，只需要压缩空气即可满足sf 9细胞的耗氧要求。但要培养同样规模的其他悬浮细胞，如BHK-21、HEK293等，在培养中后期则必须通入纯氧气方能保证DO的稳定。由此可见，相比其它哺乳动物细胞，应用反应器悬浮培养sf 9细胞的耗氧量并不突出。从设定的参数来看，本梯度试验中的参数设定最接近优化后的组合，从图3看细胞生长曲线，在第2天进入对数生长期，平均倍增时间约22~26h，细胞接种后5~6d。细胞密度即可达到峰值1.0~1.5×106cells /ml(总体积5L)，细胞状态良好，与所接细胞种的形态基本无差别。

本试验过程中，细胞培养液的pH表现的非常稳定，即使在细胞培养后期，也极少补加NaHCO3进行调节，这可能与sf 9细胞在代谢过程中利用乳酸有关[5]。

4 结论

本文中对应用激流式生物反应器大规模悬浮培养sf 9细胞的几项关键工艺参数进行了初步研究，确定优化后的工艺参数为培养温度28℃，pH6.2，转速50rpm，细胞接种密度1.0×105cells/ml，DO50%，并通过相关试验证明了上述参数的可行性。上述参数可通过相似的试验再次优化，以期得到最佳效果。同时，该结果也可以作为进一步规模放大的依据。

[1] lain R.Cameron Trendsin Biotechnology. 1989.7: 66-70.

[2] 金小红, 孟哲峰, 陈存国. 小牛血清和胎牛血清对Sf 9细胞生长和重组蛋白表达影响的比较[J]. 中国病理生理杂志, 2006(2).

[3] 王晓迟, 戚艺华, 欧阳帆. Sf 9细胞的培养工艺[J]. 化工冶金, 1998, 19(4): 277-280.

[4] 赵佼, 谭文松, 周燕等. 昆虫细胞(Sf21)悬浮培养过程中生长限制性基质间歇补加技术的应用[J]. 生物工程学报, 2000, 16(3): 357-362.

[5] 徐殿胜, 陈国豪, 陆兵等. 昆虫细胞(Sf 9)培养中葡萄糖、乳酸的影响[J]. 生物工程学报, 1996, 12(4): 508-511.

（2012–06–29）

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1007-1733(2012)08-0012-02