微波对人肺癌A549细胞凋亡的非热效应

曹慧玲 徐 冶 刘晓冬 于 洋 刘师兵 王晓军 孙路阳 李玉璞

(吉林医药学院，吉林 吉林 132013)

微波对肿瘤细胞的热损伤已广泛应用，特别对中心型支气管肺癌局部姑息治疗有重要意义。热效应之外的非热效应对肿瘤细胞的促凋亡作用日益引起重视，探讨微波非热效应对肿瘤细胞的影响，对减少照射剂量、减轻局部副损伤有一定意义。

1 材料与方法

1.1 材料 IMDM培养基、新生牛血清购于Gibco公司;一抗购自美国Santa Cruz公司;二抗、DAB及Hoechst 33342荧光染料购于北京鼎国公司;A549细胞：由吉林大学赠送，用含10%新生牛血清的IMDM培养液，置CO2培养箱(37℃、5%CO2)培养，隔2～3 d传代1次，取生长状态良好对数生长期细胞进行实验。微波仪：南京汇研MY8C-1型微波功率源。流式细胞仪：EPICS XL，Beckman。共聚焦显微镜：Olympus FV1000。

1.2 方法 将A549细胞分为空白对照组、低照射剂量组(100 W，照射强度12 mV/cm2)、中照射剂量组(150 W，照射强度18 mV/cm2)和高照射剂量组(200 W，照射强度为21 mV/cm2)，每组均在冰浴条件下〔1〕照射10 min。照射后24 h光镜下观察照相、收集细胞。

1.2.1 Western印迹法检测蛋白表达 待细胞生长到对数生长期时，离心收集细胞，每瓶加入120 μl细胞蛋白裂解液RIPA，混匀，细胞粉碎仪超声细胞2次，充分裂解细胞，离心收集上清，采用Bio-Rad法测定蛋白含量。SDS-PAGE电泳分离蛋白利用湿转法将分离胶上蛋白转移到PVDF膜上。转膜完成后，用5%脱脂奶粉封闭1 h，PBST洗3次，加入相应一抗(1∶200稀释)4℃过夜。第二天，PBST洗3次，加入过氧化物酶标记二抗(1∶1 000稀释)，摇床摇1 h;PBST洗3遍。DAB显色，凝胶成像系统拍照;同时以β-actin作为内参照。

1.2.2 Rh123染色检测细胞凋亡 消化并收集细胞，PBS洗2次，取2×106个细胞，加 Rh123染液5 μg/ml，37℃避光孵育30 min，PBS洗2次，重悬于500 μl PBS中，流式细胞仪检测。

1.2.3 间接免疫荧光、Hoechst 33342染色检测细胞凋亡 取细胞密度1×105/ml置于24孔板中，每孔500 μl接种过夜。爬片固定后经0.1%Triton-PBS作用5 min，非免疫山羊血清封闭30 min，加入一抗4℃过夜;洗涤后加入荧光二抗30 min，洗涤后抗荧光淬灭剂封片。Hoechst 33342染色法省去一抗和二抗孵育步骤，直接加入Hoechst 33342染色液室温15 min，洗涤后抗荧光淬灭剂封片。激光共聚焦显微镜观察。

1.3 统计学分析 采用SPSS11.0软件进行分析，计量资料以s表示，组间比较采用t检验。

2 结果

2.1 不同剂量微波照射A549细胞后光镜下形态变化 与对照组相比，照射剂量越大细胞数减少越明显，细胞回缩变圆，细胞质越致密。见图1。

2.2 不同剂量微波照射A549细胞后流式分析凋亡结果 随着微波照射强度的增加，A549细胞结合Rh123的能力下降，高荧光密度群百分率减少、平均荧光密度下降、低荧光密度群百分率增加(2.9%vs 5.4%、7.6%、9.9%;P＜0.01)。见图2。

2.3 不同剂量微波照射A549细胞后Hoechst 33342与间接免疫荧光染色共聚焦检测凋亡结果 微波照射A549细胞后，间接免疫荧光法检测到细胞凋亡蛋白caspase3活化增多，荧光强度随剂量的增加而增强。A549细胞被微波照射后，蓝色荧光强度随着照射剂量的增大而增高，核碎裂细胞增多。见图3，图4。

2.4 不同剂量微波照射后Western印迹检测凋亡蛋白变化

各照射组Bax/Bcl-2均高于对照组(P＜0.01)，照射剂量越大该比值越高;各照射组Caspase3均高于对照组(P＜0.01)，照射剂量越大，该值越高。见图5，图6。

图1 微波作用A549细胞光镜变化(×200)

图2 微波作用A549细胞后Rh123染色流式细胞仪检测线粒体膜电势变化

图3 Hoechst 3342染色共聚焦显微镜检测细胞凋亡

图4 间接免疫荧光法共聚焦显微镜检测活性caspase3

图5 微波作用A549细胞后凋亡蛋白表达变化

图6 Western印迹结果统计分析

3 讨论

微波在医疗方面有着广泛的应用。高强度微波主要显现的是热效应，而低强度产生的非热效应对生物体的影响和作用机制均不明确〔2〕。与正常细胞比较，肿瘤细胞的特点是凋亡减少、增殖旺盛。已有资料表明：暴露于非热的微波中可诱发人上皮癌KB细胞凋亡且呈时间依赖性〔3〕。因此，关注微波非热效应是否能诱导人肺癌A549肿瘤细胞凋亡及其机制，探索低强度微波在生物治疗领域的应用价值显得尤为重要。

有实验用加热处理摈除微波热效应的影响，强烈提示微波对微生物存在着明显的非热效应〔4〕。本实验采用的是在冰浴摒除热效应条件下，不同剂量微波照射10 min后24 h光镜观察：结果显示，随着照射剂量增大，细胞数减少明显，细胞回缩变圆，细胞核轮廓不清，细胞质致密，符合凋亡前细胞的非特异性变化。在微波辐射诱导下定位于线粒体的Bcl-2表达下降、Bax表达上升，定位于胞质的Caspase3增加，此过程促进了线粒体途径的细胞凋亡。线粒体是真核细胞的重要细胞器，是动物细胞生成ATP的主要地点。线粒体跨膜电位的耗散与细胞凋亡有密切关系。微波能够影响膜的通透性及膜电位，导致电穿孔〔5〕。随着照射强度的增加，A549细胞膜电位发生了变化，使其结合Rh123的能力明显下降，表现为Rh123染色显示低荧光密度群百分率显著增加;凋亡细胞膜通透性增强，使Hoechst 33342能较多地进入其中，同时凋亡细胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到损伤，不能有效地将Hoechst 33342排出到细胞外，使之在细胞内积累，表现为荧光强度增高。

本实验表明微波的非热效应对人A549细胞有明显的促凋亡作用。微波非热作用除促进细胞凋亡外，还通过改变离子通道、诱发氧自由基等途径〔6〕破坏肿瘤细胞。这些作用尚需更多实验数据证明。

1 谢长宜，王 易.微波非热效应对杂交瘤细胞的影响研究〔J〕.自然杂志，2000;22(5)：305-6.

2 Sannino A，Sarti M，Reddy SB，et al.Induction of adaptive response in human blood lymphocytes exposed to radiofrequency radiation〔J〕.Radiat Res，2009;171(6)：735-42.

3 Caraglia M，Marra M，Mancinelli F，et al.Electromagnetic fields at mobile phone frequency induce apoptosis and inactivation of the multi-chaperone complex in human epidermoid cancer cells〔J〕.J Cell Physiol，2005;204(2)：539-48.

4 王晓庆，张泽华，王广军，等.微波场对微生物DNA的作用研究〔J〕.中国消毒学杂志，2009;26(1)：1-4.

5 卢恩勇，徐向民，赖声礼.微波的生物效应及研究进展〔J〕.广州医药，2005;36(1)：4-7.

6 杨少华.2450MHz微波生物学效应的研究进展〔J〕.华夏医学，2006;19(1)：172-4.