帕金森病大鼠发病过程中纹状体区乙酰胆碱水平动态变化及行为学观察

曹 非 骆 芳 陈 涵 魏桂荣 乔 娴 孙圣刚 梅元武 童萼塘

(华中科技大学同济医学院附属协和医院神经内科，湖北 武汉 430022)

帕金森病(PD)是一种慢性退行性神经变性疾病，其发病原理是多因素导致黑质致密部的多巴胺神经元变性缺失，引起多巴胺(DA)含量降低，DA-乙酰胆碱(Ach)平衡失调，造成Ach系统功能相对亢进从而致病。目前有关于PD发病中Ach动态改变罕见报道。本研究据此采用大鼠PD模型，动态观察纹状体Ach变化，同时观察相应PD大鼠行为学改变。

1 材料与方法

1.1 动物选择与分组 选用健康Wistar雄性大鼠36只(同济医科大学实验动物中心提供)，体重180～200 g，由华中科技大学同济医科大学动物实验中心提供。饲养条件室温，光照每日14 h，自由饮食和水。经检测无旋转行为后随机分为四大组。A：正常组，B、C、D 三组行 6-羟基多巴胺(6-OHDA)注射液注射。6-OHDA注射液：6-OHDA、维生素C干粉剂(Sigma公司产品)按2.5∶1的比例用生理盐水配制成0.3%6-OHDA注射液，即配即用，密封、低温、避光保存。脑立体定位注射术，观察时点为注射6-OHDA 后1、7、14、21 d。B：术后7 d 组，C：术后14 d组，D：术后21 d组，A、B、C、D 组各9只大鼠。

1.2 PD大鼠模型制作 按改良的Thomas方法〔1〕制作PD大鼠模型：大鼠用7%水合氯醛(0.6 ml/100 g)腹腔注射麻醉后，头颅水平位固定在脑立体定位仪(西北光学仪器厂制造)上，上切牙平面比耳间线平面低2.4 mm(即齿棒低于耳间线)2.4 mm，保证前、后囟处于同一水平面，各个方向轻轻摇动证明头部确实固定可靠后进入下一步;剃除大鼠头顶部毛发，手术区碘酒酒精消毒，于颅中部正中切开头皮和筋膜，切口长度1.5 cm，剥离骨膜，棉球蘸取纯双氧水使前囟充分暴露，参照包新民等著《大鼠立体定位图谱》确定右侧黑质致密部、中脑腹侧被盖部(VTA)三维坐标位置，SNc区坐标：前囟后4.8 mm，中线右侧2.0 mm，硬膜下7.5 mm，VTA区坐标：前囟后4.4 mm，中线右侧1.2 mm，硬膜下7.5 mm，用脑外科电动颅骨钻钻颅孔(直径3 mm)2个，用10 μl微量注射器抽取0.3%6-OHDA，按坐标每个点注射3.3 μl，注射时缓慢进针，注意针尖斜面向尾侧，注射速度 0.5 μl/min，注射完毕，停针 10 min，在按1.0 mm/min速度缓慢拔针，明胶海绵填塞颅骨孔，缝合皮肤筋膜，马应龙软膏涂抹缝线处，术后大鼠包被保暖，清醒后置笼喂养。

1.3 高效液相电化学方法测纹状体多巴胺及代谢产物的含量

1.3.1 样品制备 四个时点组行为学测试后，分别随机选择成模大鼠行单胺类递质含量的测定。与上午九点断头取脑，在冰台上快速取出双侧纹状体，称重，临时保存于液氮中，后转移至－80℃冰箱。待测时按30 μl/10 mg加入0.05 mol/L的高氯酸，除去蛋白，在冰浴中用玻璃匀浆器混合匀浆，匀浆液于4℃低温离心，取上清液加样行高效液相色谱电化学检测。

1.3.2 Ach高效液相色谱分析〔1〕将动物断头取脑，在冰台上迅速分离纹状体，称重，于液氮中保存。测定组织乙酰胆碱含量时，在含0.04%(W/V)Na2S2O5和0.04%(W/V)依地酸的0.1 mol/L(1 ml/0.1 g脑组织)的冰过氯酸(PCA)中20 s组织匀浆。组织匀浆液4℃离心。超浮游物0.2 μm多孔板过滤，每1 ml放于1.5 ml瓶中，－80℃储存。样品测Ach时以缓冲液1∶2体积稀释后注入高效液相色谱系统〔2〕。DA的检测在按30 μl/10 mg加入0.1 mol/L高氯酸，冰浴下匀浆，高速低温离心机离心，取上清供检测〔3〕。

1.4 行为学观察 大鼠在预定时点的第二天上午8点进行行为学观察，通过腹腔注射APO 0.5 mg/kg，在直径为40 cm的不锈钢盆中观察大鼠的旋转行为，时间2 h，用钟式测转仪测量旋转次数。

2 结果

2.1 纹状体Ach含量 模型组Ach的含量呈现逐渐变化的趋势，在7 d组没有明显变化;14 d，21 d组逐渐上升，与空白对照组对比有显著性差异(P＜0.05)。见表1。

2.2 行为学观察 给予阿朴吗啡腹腔注射，5～10 min后可观察到大鼠有嗅探，闭眼，僵直，肌震颤，不久开始出现向注射对侧旋转。旋转时大鼠身体向左侧曲成环状，首尾相接，以左后肢为支点向左侧旋转。旋转次数≥7 r/min为成功模型。正常对照组未出现任何行为学变化，B、C、D组随着时间增加，大鼠转圈数7 d的4 r/min猛增到21 d的313 r/min。见表1。

表1 PD大鼠纹状体区Ach、大鼠旋转行为比较(s)

表1 PD大鼠纹状体区Ach、大鼠旋转行为比较(s)

与A组比较：1)P＜0.05;与 B组比较：2)P＜0.05;与C组比较：3)P＜0.05

组别 n 旋转圈数(r/min)Ach含量(μg/g)A组19.67±7.40 B组 9 4.22±1.86 21.08±4.27 C组 9 10.29±2.211)2) 27.86±6.401)2)D组 9 313.38±2.921)2)3) 31.74±10.031)2)3)9 0

3 讨论

Lacroix〔1〕认为PD发病的根本原因就是黑质DA神经元丢失以及随后发生的DA-Ach浓度比例失衡，黑质DA神经元缓慢丢失到超过50%才出现临床症状。同等条件下采用6-OHDA脑立体定向注射制作的PD模型成功，出现行为学改变时间为2 w，这已在大量相关模型试验研究中得到很好地印证〔2〕。本研究证实了PD纹状体区DA/Ach这一对递质的平衡失常不仅仅是由于DA的降低所致，Ach的上调更加重了这种失衡。随着病情的进展，DA神经元进一步减少，对Ach的拮抗作用大大降低，这时纹状体内Ach的含量绝对升高，进而产生M型ACh受体兴奋时的肌肉震颤，肌张力增加等临床症状〔3〕从行为学上观察我们发现，当PD模型制作的大鼠，给予阿朴吗啡腹腔注射，5～10 min后可观察到大鼠有嗅探，闭眼，僵直，肌震颤，不久开始出现向注射对侧旋转。旋转时大鼠身体向左侧曲成环状，首尾相接，以左后肢为支点向左侧旋转。旋转次数≥7 r/min为成功模型。正常对照组未出现任何行为学变化，从1～21 d，B、C、D组随着纹状体Ach含量的增加，大鼠转圈数也从7 d的4 r/min猛增到21 d的313 r/min。

随着研究深入，已经发现选择性Ach受体拮抗剂毒副作用明显低于目前使用的抗胆碱药物〔3，4〕，且迄今为止这方面的认识很少，有广阔的研究价值和临床应用前景。

1 Lacroix LP，Ceolin L，Zocchi A.Selective dopamine D(3)receptor antagonists enhance cortical acetylcholine levels measured with high-performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry without anti-cholinesterases〔J〕.J NeurosciMethods，2006;157(1)：25-31.

2 Tian Q，Lin ZQ，Wang XC，et al.Injection of okadaic acid into the meynert nucleus basalis of rat brain induces decreased acetylcholine level and spatial memory deficit〔J〕.Neuroscience，2006;126：277.

3 Arruda Paes PC，de Magalhaes L，Camillo MA，et al.Ionotropic glutamate receptors regulating labeled acetylcholine release from rat striatal tissue in vitro：possible involvement of receptor modulation in magnesium sensitivity〔J〕.Neurosci Res，2004;49(3)：289-95.

4 Quarta D，Ciruela F，Patkar K.Heteromeric nicotinic acetylcholine-dopamine autoreceptor complexes modulate striatal dopamine release〔J〕.Neuropsychopharmacology，2006;170(1)：148-55.