胰岛素对初诊2型糖尿病患者Th1/Th2平衡的影响

吴晓燕 汤旭磊 傅松波 杨 芳 高 林 (兰州大学第一医院内分泌科，甘肃 兰州 730000)

2型糖尿病(T2DM)患者存在Th1/Th2细胞失衡〔1〕，研究发现胰岛素(Ins)治疗可能调节Th淋巴细胞的功能〔2〕。本研究拟通过测定Ins治疗前后T2DM患者及正常人外周血中的Th1、Th2细胞及其 Th1/Th2比值，探讨 T淋巴细胞亚群与T2DM发病的关系以及Ins对新发T2DM患者的Th1/Th2平衡的免疫调节作用。

1 对象与方法

1.1 研究对象 正常对照组：20例，男12例，女8例，健康体检者，年龄(50.5±6.0)岁，汉族，无糖尿病及其他自身免疫性疾病。糖尿病组：新诊断的T2DM患者30例，男16例，女14例，系本院内分泌科住院患者，年龄(52.9±9.7)岁，44～78岁。入组患者均无糖尿病急慢性并发症，也无自身免疫性疾病，感染，肿瘤等。

1.2 试剂与仪器 PERCP标记的抗CD4单抗，PE标记的抗IL-4单抗，PITC标记的抗IFN-γ单抗，均为鼠抗人。FITC和PE，PERCP标记的鼠IgG1同型对照免疫球蛋白，佛波醇乙酯(PMA)，离子霉素(Ionomycin)，布雷菲德菌素 A(BFA)和Fix＆Perm破膜剂均购自美国 Caltag公司。高敏 C反应蛋白(hs-CRP)试剂盒晶美生物工程有限公司。胰岛素(Ins)试剂盒天津九鼎生物技术有限公司。流式细胞仪为美国Coulter公司EPICS-XL型。

1.3 方法

1.3.1 试验设计 对符合条件的30例患者，入组时及治疗12 w后查HbA1c、Th1、Th2空腹及 OGTT2h血糖、空腹及 OGTT 2 h胰岛素，血清hs-CRP，并记录体重变化。试验期间，尽量使空腹血糖小于7.0 mmol/L、餐后2h血糖小于10 mmol/L为满意，根据血糖调整Ins用量。

1.3.2 Th1/Th2流式细胞术检测 肝素抗凝血5 ml，淋巴细胞分离液分离单核细胞，将细胞数调整至1×106/ml，将细胞悬液加入24孔细胞培养板中，加入刺激剂PMA(20 ng/ml)，离子霉素(1 μg/ml)和蛋白质转运抑制剂BFA(2 μg/ml)以阻止细胞因子向细胞外分泌。37℃，5%CO2环境下培养5 h，对细胞表面抗原进行染色，加入破膜剂进行固定-破膜打孔以利于细胞因子单抗进入细胞，进行细胞内细胞因子染色，每管加入10 μl INF-γ单抗和IL-4单抗，以相应的同种型对照IgG单抗作对照染色，应用流式细胞仪对分泌INF-γ的CD4+细胞Th1和分泌IL-4的CD4+细胞Th2进行检测。

1.3.3 血清hs-CRP的测定 取晨起空腹静脉血2 ml，用ELISA测定。单位为ng/ml。正常参考值为254～16 104 ng/ml。

1.3.4 血糖、胰岛素及相关指标的测定 空腹10 h取晨血5 ml测定空腹血糖(FBG，葡萄糖氧化酶法)、空腹血清胰岛素(FINS、放射免疫法)、Homa B胰岛素分泌指数=20×空腹胰岛素/(空腹血糖－3.5)是评价胰岛β细胞分泌功能的一个指标，胰岛素敏感性指数(ISI)=ln〔1/空腹血糖(mmol/L)×空腹胰岛素(mU/L)〕是评价胰岛素抵抗的一个指标。糖化血红蛋白(HbA1c)，免疫分析法，德国Bayer公司DC2000型HbA1c检测仪及检测试剂盒。

1.4 统计学方法 采用SPSS8.0统计软件包。正态资料以s表示，偏态资料经对数转换后按正态资料数据处理，组间比较用单因素方差分析，再以SNK行组间两两比较。相关分析用直线相关。

2 结果

2.1 各组临床资料比较 T2DM患者Ins治疗前的Th1百分比，Th1/Th2比值较正常对照组明显下降(P＜0.05)，Th2与正常对照组无明显差异，血清hs-CRP浓度显著高于正常对照组(P＜0.01)，Homa B较正常组显著下降(P＜0.01)。T2DM患者Ins治疗后与治疗前相比Th1细胞百分比显著性升高(P＜0.05)，Th2细胞百分比下降，但无统计学意义(P＞0.05)，治疗前后Th1/Th2比值相比差异有显著性(P＜0.05)。Homa B较治疗前显著上升，差异有统计学意义(P＜0.01)。C反应蛋白较治疗前明显下降，差异有统计学意义(P＜0.05)。治疗后Th1、Th2细胞百分比、Th1/Th2比值与对照组比较差异无显著性(P＞0.05)。见表1。

表1 2型糖尿病患者治疗前后与正常人临床及实验室资料比较(s)

表1 2型糖尿病患者治疗前后与正常人临床及实验室资料比较(s)

与正常对照组比较：1)P ＜0.05，2)P ＜0.01;与治疗前比较：3)P ＜0.05，4)P ＜0.01

Homa B ISI T2DM治疗前 24.02±0.70 10.93±0.702) 1.99±0.281) 2.82±0.35 0.76±0.062) 9.70±1.011) 33 281±1 1682) 25.8±7.92)组别 BMI(kg/m2)FBG(mmol/L)Th1(%)Th2(%)Th1/Th2 HbA1c(%)hs-CRP(ng/ml)－2.73±0.27 T2DM治疗后 24.62±0.43 6.54±0.824)2.89±0.313)2.23±0.27 1.35±0.083)6.21±0.833)16 564±1 0453)69.8±11.44)－2.56±0.22正常对照组 23.32±0.57 5.00±0.26 3.28±0.21 2.45±0.22 1.45±0.12 5.00±0.74 10 073±1 177 86.3±17.1 －2.22±0.14

2.2 T2DM患者外周血Th1/Th2淋巴细胞及血清hs-CRP水平与ISI相关性 T2DM患者外周血Th1淋巴细胞值与HbA1c具有明显的相关性(r=－0.68，P＜0.01)，患者Th2及Th1/Th2与HbA1c之间无相关性(P＞0.05)。Th2淋巴细胞值与Homa B具有明显的相关性(r=－0.54，P＜0.01)。T2DM患者血清hs-CRP水平与ISI呈显著负相关(r=－0.38，P＜0.01)。

3 讨论

研究认为T2DM可能是炎症因子介导的免疫炎症反应，炎症因子导致了胰岛B细胞分泌胰岛素功能受损及产生胰岛素抵抗〔3，4〕。CD4+T辅助细胞(Th)是构成机体免疫系统的一种主要细胞，Th1细胞主要负责细胞免疫应答、迟发性超敏反应(炎症反应)、Th2细胞与体液免疫有关。生理条件下，机体的Th1细胞和Th2细胞处于相对平衡状态，在疾病状态下，这种平衡被打破，Th1，Th2细胞所致不同优势免疫应答与疾病的发生，发展，预后有关。近来Th1/Th2细胞与糖尿病的关系日益受到关注，Katz等〔5〕认为Th1细胞有可能促进1型糖尿病的发生，而Th2细胞对1型糖尿病有保护作用，Th1/Th2细胞的失衡在1型糖尿病的发生中发挥了重要的作用。本研究发现与1型糖尿病不同，新诊断的T2DM患者Th1细胞百分比降低，而Th2细胞百分比升高，Th1/Th2比值明显下降，提示T2DM是一种Th2占优势的疾病。本研究还发现，T2DM患者Th1值与糖化血红蛋白呈负相关，Th2淋巴细胞值与Homa B具有明显的负相关，提示Th1细胞劣势所致的细胞免疫缺陷可能引起了高血糖的发生，Th2淋巴细胞的升高导致了胰岛β细胞分泌功能的下降。虽然Th2与正常人比无差异，但Th1细胞亚群的改变导致了Th2亚群的变化，Th2型细胞因子促进B细胞活化，而产生过量IgG，也可促进杀伤性T淋巴细胞克隆的过度激活，该作用与其他细胞因子和效应分子产生的细胞毒作用结合，可以引起胰岛β细胞死亡〔6〕，Th2细胞因子可能也通过体液免疫途径参与了T2DM患者的发病。

近来研究显示，在T2DM的早期给予胰岛素短期强化治疗，可以带来长期改善血糖控制的作用，可以使患者及时回到T2DM自然病程的早期阶段〔7〕。Ins是一种广泛调节细胞功能的激素，体外研究发现，低浓度的Ins可抑制Th2类细胞因子分泌而增加Th1类细胞因子分泌，能通过调节淋巴细胞分泌Th1/Th2细胞因子的作用而影响免疫系统功能〔8〕研究发现Ins除了使1型糖尿病胰岛β细胞得到充分休息外，还可能调节T淋巴细胞Th2亚群，恢复Th1/Th2之间的平衡，胰岛素可促进Th2功能，抑制Th1细胞杀伤能力，减少对胰岛β细胞的免疫杀伤〔9〕。研究发现，胰岛素能诱导NOD小鼠抗原特异性调节T细胞产生，通过分泌IL-4，IL-10，TGF-β在胰岛内抑制Th1型细胞及其他效应细胞，使IFN-γ表达显著下调，从而保护胰岛免受破坏，分泌胰岛素维持正常血糖〔10〕。

本研究发现胰岛素治疗后T2DMTh1升高，Th2降低，从而使Th亚群平衡向Th1方向漂移。减轻了炎症反应，改善了胰岛β细胞的分泌功能。本文发现，T2DM患者外周血中Th1、Th2水平与上述1型糖尿病患者结果呈现相反的情形，Th1细胞表现下降趋势，Th2细胞表现上升趋势。提示不同类型的糖尿病，Th细胞亚群表现不同的细胞优势，这一结论尚需后续的大量研究进一步探讨。故目前尚不能简单认为对于糖尿病患者来说，Th1细胞一定有益，而Th2细胞一定有害，而应从Th1/Th2失衡方面去进行更为深入的研究。

1 吴晓燕，汤旭磊，高 林.2型糖尿病免疫炎症的初步探讨〔J〕.中国免疫学杂志，2007;23(10)：944-6.

2 The EURODIAB Substudy 2 Study Group1.Decreased prevalence of atopic diseases in children with diabetes〔J〕.J Pediatr，2000;137：470-4.

3 邱明才.糖尿病的多器官免疫损伤〔J〕.国际内分泌代谢杂志，2006;26(3)：215-6.

4 Fsta A，Agostno RD，Howeard G，et al.Chronic subclinical inflammation as part of the insulin resistance syndrome〔J〕.Circulation，2001;102(1)：42-7.

5 Katz JD，Benoist C，Mathis D.T helper cell subsets in insulin-dependent diabetes〔J〕.Science，1995;268(5214)：1185-8.

6 John A，Colwell MD.Inflammation and diabetic vascular complications〔J〕.Diabetes Care，1999;22(12)：1927-8.

7 祝 方，纪立农，韩学尧，等.短期胰岛素强化治疗诱导初诊2型糖尿病患者血糖长期良好控制的临床试验〔J〕.中国糖尿病杂志，2003;11(1)：5-9.

8 Glasdone P，Nepom GT.The prevention of IDDM.Injecting insulin into the cytokine network〔J〕.Diabetes，1995;44：859-62.

9 高 云，何权瀛，马艳良.胰岛素对体外培养人淋巴细胞生成Thl/Th2因子平衡的调节作用〔J〕.中国糖尿病杂志，2007;15(2)：107-8.

10 Leng Q，Bentwich Z.Beyond self and nonself：fuzzy recognition of the immune system〔J〕.Scand J Immunol，2002;56(2)：224-32.